安石榴苷体外抑菌及体内抗沙门氏菌感染的作用及机理研究
第一章 文献综述
石榴皮是石榴的干燥果皮，研究表明石榴皮具有降血脂、抗病毒、抗氧化、抗腹泻、抗肿瘤及抗菌等生理活性（热依木古丽·阿布都拉等 2013）。石榴皮具有丰富的多酚类物质，约为石榴皮干重量的 10%～20%，其组分为安石榴苷、没食子酸、表儿茶素、石榴皮亭 A、石榴皮亭 B、鞣花酸等，其中安石榴苷含量最高（杨筱静等 2013）。石榴皮占石榴的 20%～30%，除少数药用外，绝大部分却没有被充分的利用，几乎被废弃，造成资源的极大浪费。目前，石榴皮的应用主要集中在食品、药品、日化用品和功能高分子材料等方面。
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1.2.1 结构特性及来源
安石榴苷（2, 3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-4, 6-(S, S)-gallagyl-Dglucose）是一种多羟基的酚类化合物，分子式为 C48H27O30，分子量为 1084.72。安石榴苷为棕褐色粉末，易溶于水，乙醇和甲醇等，属于水解性单宁。安石榴苷的化学结构式如图 1-1所示。
1.2.2 生理活性功能
1.2.2.1 抗氧化作用
安石榴苷具有酚羟基的结构，是石榴皮多酚中起关键抗氧化作用的成分。体外研究表明，安石榴苷具有较强的清除超氧阴离子自由基（O2-）、ABTS·自由基、DPPH·自由基以及 H2O2的能力；另外，安石榴苷对脂质的过氧化具有一定的抑制作用（Aqil et al.2012；Seeram et al. 2005；Kulkarni et al. 2004；梁俊等 2012）。
1.2.2.2 抗病毒作用
安石榴苷对单纯疱疹 1 型病毒、巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、革登病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒等具有抑制作用，其机理主要是干扰病毒与细胞表面的氨基多糖（GAGs）的相互作用（Lin et al. 2013）。另外，Yang et al.（2012）通过小鼠实验证明安石榴苷能降低肠病毒 71 引起的细胞病变，降低小鼠的死亡率并减轻肠病毒感染小鼠的临床症状。
1.2.2.3 抗菌作用
研究表明，安石榴苷具有抑制多种食源性致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和弧菌）的能力，其最小抑菌浓度（MIC）范围为 45 μg/ml~3 200 μg/ml（Taguri etal. 2004）。其次，安石榴苷对真菌（Alternaria alternata, Penicillium digitatum, Penicilliumexpansum 等）也具有较强的抑制作用（Glazer et al. 2012）。另外，Li et al.（2014）表明富含安石榴苷的石榴皮提取物对单核增生李斯特菌具有抑制作用，其机理为富含安石榴苷的石榴皮提取物破坏单核增生李斯特菌细胞膜的结构，使胞内的紫外物质、钾离子和ATP 释放到胞外，细胞膜电势和胞内外 pH 值差也发生改变；另外，李斯特菌的菌体形态也发生了变化。
1.2.2.4 护肝作用
Lin et al.（1998，2001）研究表明安石榴苷对四氯化碳或乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤具有治疗作用；安石榴苷能够降低肝损伤小鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量，并能减轻四氯化碳或乙酰氨基酚对小鼠所造成的肝中央静脉病理病变以及氧化损伤。
1.2.2.5 抗炎作用
在炎症反应的过程中，安石榴苷能够抑制巨噬细胞 RAW264.7 合成 NO，并能够减少白介素（IL）-6，IL-1β，肿瘤坏死因子（TNF）-α 和前列腺素 E2（PGE2）的分泌；同时，通过抑制 IκBα 和 p65 的磷酸化而抑制 MAPK 和 NF-κB 通路的激活（Xu et al.2014）。另外，安石榴苷能抑制 CD4+T 细胞合成 IL-2，并通过动物实验表明安石榴苷能够抑制丙二醇甲醚醋酸酯诱导的小鼠耳部慢性水肿或者角叉菜胶诱导的鼠急性足爪肿胀（Lee et al. 2008；Lin et al. 1999）。
第二章 石榴皮中抑菌活性物质的筛选
石榴（punica granatum L.）为石榴科、石榴属植物，是传统的药食两用植物之一，具有极高的营养价值和药用价值；研究表明，石榴具有涩肠止泻、抗氧化、抗病毒、抗癌等功能（Jurenka 2008；Miguel et al. 2010）。目前，国内外对石榴皮抑菌活性的研究主要集中在石榴皮粗提物抑菌方面，而石榴皮中起抑菌作用的主要成分还未见报道（Malviya et al. 2014；Finegold et al. 2014；董周永等 2008a 和 2008b）。因此，本章以食品中常见的致病菌为供试菌，研究石榴皮中主要的成分对致病菌的抑制效果，确定石榴皮中起主要抑菌作用的活性成分，为石榴皮的开发利用奠定理论基础。
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2.1 材料与方法
蛋白胨缓冲液（BPW）、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）、氯化镁孔雀绿肉汤增菌液（RV）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基（XLD）、Luria-Bertan（LB）琼脂培养基和Luria-Bertani（LB）肉汤培养基等：北京陆桥技术有限责任公司；XLT4培养基：美国DIFCO 公司。鼠伤寒沙门氏菌 SL 1344：由程相朝教授（河南科技大学）惠赠；单核增生李斯特菌 CMCC 54004：购于中国医用菌种保藏中心；金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、大肠杆菌 ATCC 25922 和沙门氏菌 LT2：由崔生辉（中国药品生物制品检定所）博士惠赠；食物源沙门氏菌：共 9 株，分别于 2007-2012 年，分离自广西、北京、河南和陕西等地零售鸡肉样品。
2011 年 10 月，峄城软籽石榴购于陕西省西安市临潼区。果实于当天采摘并运回实验室；剔除裂果和病害果后，用自来水洗净，手工取皮，并置于恒温干燥箱（50 ℃）内；果皮烘干后，用小型粉碎仪粉碎果皮，粉末过 60 目筛并置于密封袋中，于-20 ℃保存备用。
2.1.2 方法
2.1.2.1 石榴皮提取物的制备
提取溶剂为丙酮（浓度为 60%），料液比为 1：10，用超声波进行辅助提取（40 ℃，100 W，10 min），用真空泵进行抽滤，分别得到滤渣和滤液；相同的提取条件下，对滤渣进行二次提取，合并提取液；用旋转蒸发仪进行浓缩（50 ℃），得到浓缩液并于 4 ℃保存备用。
2.1.2.2 石榴皮提取物的纯化
（1）Amberlite XAD-16 预处理 参照朱静等（2010）所报道的方法，步骤如下：①用无水乙醇浸泡大孔吸附树脂（XAD-16）24 h，并用去离子水洗至无醇味；②用 3%HCl 浸泡大孔吸附树脂（XAD-16）3 h，并用去离子水洗至中性；③用 3% NaOH 浸泡大孔吸附树脂（XAD-16）3 h，并用去离子水洗至中性；④用 3% HCl 浸泡大孔吸附树脂（XAD-16）3 h，并用去离子水洗至中性；⑤将大孔吸附树脂（XAD-16）浸泡于无水乙醇中或直接使用。
（2）单宁的纯化 取一定量大孔吸附树脂（XAD-16），用湿法进行装柱（柱长径比为 6:1），装柱的过程中保证无气泡产生；取一定体积的提取物浓缩液进行上样（上样量为 200 ml 浓缩液/500 g 树脂）；最后进行洗脱，步骤大致如下：
首先，用水（约 4 L）进行洗脱以除去多余的糖，直至流出液体为澄清；其次，用约 800 ml 的甲醇（100%）洗脱，收集洗脱液，并于 50 ℃旋转蒸发；最后，将浓缩液进行真空冷冻干燥，得到粉末状的纯化物。
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2.2.1 石榴皮粗提物及纯化物的成分及含量
由图 2-1A 可知，在 2.1.2.3 所设定的条件下，混合标样中含有的标准品（没食子酸、安石榴苷 α 和 β 及鞣花酸）得到良好的分离；其中，峰 1 为没食子酸，峰 2 和 3 为安石榴苷 α 和 β，峰 4 为鞣花酸，安石榴苷 α 和安石榴苷 β 为同分异构体。
利用上述已确定的色谱条件对石榴皮粗提物和纯化物中多酚的含量进行测定，并根据混合标样中峰的保留时间，按照标品所对应的标样方程，确定粗提物和纯化物中多酚的种类和含量。由结果可知，石榴皮粗提物中没食子酸的质量分数（下同）为 0.1%，安石榴苷（含 α 和 β 同分异构体）为 12.3%，鞣花酸为 0.7%；大孔吸附树脂（AmberliteXAD-16）纯化后，样品中安石榴苷为 64.2%，鞣花酸为 2.1%，未检出没食子酸；说明，石榴皮纯化物以单宁类物质为主。
2.2.2 沙门氏菌的耐药性
根据 CLSI（2012）的方法，我们对从食品中分离得到的 9 株沙门氏菌进行耐药性检测，结果见表 2-2。可知，从食品中所获得的 9 株沙门氏菌对 15 种抗生素表现出不同的耐药性，展现出不同的耐药谱。
2.2.3 安石榴苷的成分及含量
试验所使用的安石榴苷标品（由成都曼思特生物科技有限公司提供，从石榴皮中提取）的成份及含量如图 2-2 所示。可知，标品中安石榴苷 α 的含量为 39.63%，安石榴苷β 的含量为 58.50%，安石榴苷的总含量为 98.13%。
2.2.4 石榴皮中抑菌活性物质的筛选
以金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、沙门氏菌 SL 1344 和李斯特菌 CMCC 54004 为受试菌，探究石榴皮粗提物、石榴皮纯化物及石榴皮中主要的活性物质（安石榴苷、鞣花酸和没食子酸）对这 3 种致病菌的抑制作用，结果见表 2-3。
可知，石榴皮粗提物、石榴皮纯化物和石榴皮中主要的活性物质（安石榴苷、鞣花酸和没食子酸）对这 3 种常见的食源性致病菌具有一定的抑菌作用；这 5 种物质对受试菌的抑菌效果为：安石榴苷>没食子酸>石榴皮纯化物>石榴皮粗提物>鞣花酸；对于安石榴苷，其对致病菌的抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>沙门氏菌>李斯特菌。石榴皮中主要的活性物质为安石榴苷、鞣花酸和没食子酸，安石榴苷的含量远高于鞣花酸和没食子酸，因此可以推测安石榴苷是石榴皮中起主要抑菌作用的活性成分。
2.2.5 安石榴苷对食源性致病菌的最小抑菌浓度
安石榴苷对沙门氏菌（不同来源、不同耐药性和不同血清型）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌的 MIC 见表 2-4。可知，安石榴苷对不同来源、耐药性及血清型的沙门氏菌具有不同程度的抑制作用，其 MIC 为 250-1000 μg/ml，安石榴苷对SL1344 的 MIC 为 500 μg/ml。另外，安石榴苷对金黄色葡萄球菌、李斯特菌和大肠杆菌的 MIC 分别为 250 μg/ml，，2500 μg/ml 和 10000 μg/ml；金黄色葡萄球菌对安石榴苷最敏感，其次为沙门氏菌、李斯特菌，而大肠杆菌对安石榴苷的敏感性较差。
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3.1 材料与方法............................................... 32
3.1.1 材料..................................................... 32
3.1.2 方法..................................................... 33
第四章 安石榴苷对沙门氏菌运动性及相关基因的影响...............41
4.1 材料与方法................................................. 41
4.1.1 材料........................................................ 41
第五章 安石榴苷对沙门氏菌群体效应的影响........................55
5.1 材料与方法................................................. 55
5.1.1 材料...................................................... 55
第八章 安石榴苷体内抗沙门氏菌感染的作用研究
石榴皮中含有多种活性物质，包括单宁类、黄酮类、生物碱及萜类等（Viuda-Martoset al. 2010）。石榴皮在许多国家的传统医药中被广泛的用于治疗多种感染类疾病，如痢疾、腹泻、寄生虫感染以及呼吸系统感染等。目前，体外研究证实石榴皮提取物具有抑制多种食源性致病菌以及病毒的作用，如大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌等，且抑菌作用主要归功于其所含的单宁类物质（董周永 2008；Machado et al. 2003；Reddy et al. 2007）。Choi et al.（2011）通过动物实验证实石榴皮粗提物能够显著减少沙门氏菌感染小鼠的病理症状和降低沙门氏菌感染小鼠的死亡率。虽然石榴皮长期以来被广泛使用，但是对其中抗感染的主要成分和其抗感染的机理尚不明确。因此，本章以石榴皮单宁的主要成分安石榴苷为材料，通过动物模型探讨安石榴苷抗沙门氏菌感染的具体功效。
8.1.1 主要试剂
安石榴苷（纯度 ≥ 98%）：成都曼思特生物科技有限公司；酶联免疫试剂盒（ELISA；IFN-γ，TNF-α，IL-6 和 IL-10）：上海鑫乐生物科技有限公司；木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）培养基，大豆酪蛋白琼脂（TSA）培养基，LB 琼脂培养基，LB 肉汤培养基：北京陆桥技术有限责任公司；NaCl，KCl，Na2HPO4·12H2O，K2HPO4，甲醛（纯度 37%-40%）（分析纯）：四川西陇化工有限公司；BCA 蛋白定量分析试剂盒和 RNA 提取试剂盒（Code No. CW0560）：北京康为世纪生物科技有限公司；反转录试剂盒（Code No.RR037A）：宝生物工程（大连）有限公司；SYBR 试剂盒（Code No. DRR820S）：宝生物工程（大连）有限公司；小鼠饲料：西安交通大学医学院实验动物中心；抗凝血真空采血管和促凝血真空采血管：河北鑫乐科技有限公司；氨苄青霉素（分析纯）：美国AMERSO 公司；质粒提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；其它试剂：均为分析纯。
8.1.3 实验动物
SPF 级健康雄性 C57BL6 小鼠 60 只，体重 18 - 22 g，购于西安交通大学实验动物中心，生产合格证号 SCXK（陕）2012-003。
8.1.4 主要试剂配制
（1）生理盐水（0.9% NaCl）：准确称取 NaCl 9.0 g，并溶于去离子水中，定容至1000 ml，高压灭菌，4 ℃保存备用。
（2）磷酸缓冲液（PBS）：同 6.1.1.5。
（3）安石榴苷溶液：准确称量安石榴苷 5 mg 和 2.5 mg，分别溶于 10 ml 0.9% NaCl溶液中，过滤后 4 ℃保存备用。
（4）LB 肉汤：称取 25.0 g 于 1 L 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌 15 min，冷却后 4 ℃保存备用。
（5）LB 琼脂：称取 40.0 g 于 1 L 蒸馏水中，混匀并完全溶解，121 ℃高压灭菌 15min，冷却至 45 ℃左右，摇匀，倾注平板。
（6）XLD：称取 58.9 g 于 1 L 蒸馏水中，加热煮沸灭菌，冷却至 55 ℃左右，摇匀，倾注平板。
（7）TSA：称取 30.0 g 于 1 L 蒸馏水中，混匀并完全溶解，121 ℃高压灭菌 15 min，冷却至 45 ℃左右，加 100 μl 氨苄青霉素至终浓度为 10 μg/ml，摇匀，倾注平板。
（8）10%甘油：取甘油 1 ml 加入 9 ml 蒸馏水中，混匀，121 ℃高压灭菌，冷却后4 ℃保存备用。
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第九章 结论、创新点与展望
本研究以安石榴苷为材料，通过 RT-PCR、ELISA、电镜以及细胞培养等技术手段从直接抑菌、影响毒力基因的表达、干扰细菌群体感应、抗粘附和侵入上皮细胞能力、免疫调节能力等角度对安石榴苷抗沙门氏菌感染的可能的多重机制进行探讨，同时通过小鼠灌胃感染实验研究了安石榴苷抗沙门氏菌感染的具体效应。本研究将为从石榴皮中开发能用于预防及控制沙门氏菌疾病的物质提供理论和实验依据。研究所取得的结果如下：
（1）安石榴苷是石榴皮中起主要抑菌功能的活性成分，其抑菌效果优于鞣花酸和没食子酸；安石榴苷对金黄色葡萄球菌 ATCC25923、沙门氏菌 SL1344、李斯特菌CMCC54004 和大肠杆菌 ATCC25922 等致病菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为 250、500、2500 和 10000 μg/ml；另外，安石榴苷对不同食品来源（不同的耐药性及血清型）的沙门氏菌具有抑制作用，其 MIC 为 250 – 1000 μg/ml。
（2）安石榴苷破坏沙门氏菌细胞膜的完整性。经安石榴苷作用后，沙门氏菌胞内物质（K+）释放到胞外，细胞膜出现去极化现象，细胞内的 pH 值显著升高，胞内外 pH值差发生改变，说明安石榴苷使沙门氏菌的细胞膜通透性发生变化；由扫描电镜的结果知，安石榴苷对沙门氏菌菌体有损伤作用，使菌体细胞表面破损，内容物溶出，导致菌体细胞死亡。
（3）安石榴苷影响沙门氏菌的运动性及相关基因的表达。在对沙门氏菌生长曲线无影响的浓度下，安石榴苷（31.250 μg/ml 和 15.125 μg/ml）抑制沙门氏菌的泳动能力和群集运动；但是，安石榴苷对沙门氏菌的蹭动能力无明显影响；RT-PCR 结果表明，安石榴苷（浓度为 31.250 μg/ml 和 15.125 μg/ml）能够使沙门氏菌鞭毛基因（fliA，fliY，fljB，flhC 等）的表达量降低；同时，安石榴苷能够影响沙门氏菌与在体内定植有关的基因（如fimD、sopB、invH、sipA、pipB、orf245、hflK、lrp、xthA、sodC 和 rpoS）的转录水平；另外，安石榴苷抑制 SPI-1 和 SPI-2 III 型分泌系统的调控因子 hilA 和 ssrB 的表达，进而显著影响沙门氏菌的毒性和致病能力。
（4）安石榴苷影响沙门氏菌的群体效应系统。浓度为 31.250 μg/ml 的安石榴苷对紫色杆菌的生长具有一定的抑制作用；在不影响紫色杆菌生长的情况下，安石榴苷（浓度为 15.125 μg/ml 和 7.563 μg/ml）能够抑制紫色杆菌分泌紫色素，进而影响群体效应系统。由 RT-PCR 的结果知，安石榴苷（浓度为 31.250 μg/ml 和 15.125 μg/ml）能够抑制沙门氏菌群体效应基因 sdiA 和 srgE 的表达，进而干扰沙门氏菌的群体效应。另外，进一步的研究表明，在体内，安石榴苷可能通过其代谢产物尿石素 A 来发挥抗沙门氏菌群体效应的作用。
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参考文献（略）
本文编号：34826
本文链接：https://www.wllwen.com/guanlilunwen/glzh/34826.html
