NAD联合目标体温管理及复合支架在治疗颅脑创伤中的基础研究

发布时间：2020-07-29 19:57

【摘要】：目的:1.目前,脑皮质撞击法是一种较为常用的颅脑创伤(TBI)模型构建方法,但具体的打击参数尚无统一标准。本部分实验通过设置脑皮质撞击仪不同参数,造成TBI大鼠模型不同程度的损伤,为构建TBI模型时参数的设定提供更多参考。2.国内在颅脑创伤的基础及临床研究中不断深化,治疗效果显著提高,但仍有诸多问题亟待解决,特别是TBI后脑水肿、线粒体的功能障碍,迟发性神经元损伤等继发性损伤的防治。然而病理过程的复杂也导致了缺乏有针对性的治疗药物。尽管制药公司投资了数十亿美元用于TBI相关药物研发,但至今仍没有明确有效的药物可用于TBI急性期的治疗。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种普遍存在的嘧啶核苷酸,在诸多细胞生理进程中发挥重要作用,包括细胞新陈代谢,ATP的生成,和DNA的修复。目标体温管理(TTM)治疗的方法一直延续至今,合理应用下可见其治疗效果十分可观。为此,本部分实验拟基于线粒体生物合成机制,探索NAD联合TTM对重度TBI神经功能的影响。3.颅脑创伤后往往由于开颅减压等原因会导致颅骨缺损,这既会影响美观,并造成患者心理上的焦虑与恐惧,同时也容易诱发癫痫发作。骨的同种异体移植物和自体移植物是当前治疗骨缺损的标准,然而在临床应用中会受到诸多客观条件限制。目前随着骨组织工程技术的发展,利用3D支架和自体干细胞联合完成颅骨缺损的修复已成为研究热点。本部分将利用骨组织工程技术构建丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架,并将骨髓间充质干细胞与其共培养,通过观察该细胞在支架上的增殖与分化,从而评估该复合支架应用于颅骨缺损修复的可能性。方法:1.56只大鼠按随机数字法随机等分为7组,即V1、V2、V3、D1、D2、D3和对照组,利用电子脑皮质打击仪构建不同损伤程度TBI模型,其中V组的打击最低点持续时间均为200毫秒,打击深度均为2mm,V1、V2和V3组的打击速率分别为3 m/s、4 m/s和5 m/s;D组的打击最低点持续时间均为200毫秒,打击速率均为5 m/s,D1、D2和D3组的打击深度分别为3mm、4mm、5mm。术后48小时行改良神经功能损伤评分、网屏实验评分、旷场试验评分,并测定脑组织含水量。2.将72只大鼠按随机数字法随机取12只大鼠作为对照组。剩余60只大鼠行TBI造模,使用3mm打击帽,使打击面与脑皮质表面基本平行并精确打击大鼠大脑皮层。按最低点持续时间均为200ms,4mm的打击深度,5m/s的打击速度构建重度TBI大鼠模型。在完成造模后,将60只TBI大鼠随机等分为5组,即TBI组(T group)、TBI+TTM组(T+T group)、TBI+NAD组(T+N group)、TBI+TTM+NAD组(T+T+N group)和TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组(T+T+N+I group)。另外12只大鼠不进行任何处理,作为对照组(C group)。将NAD的前体-烟酰胺单核苷酸(NMN)和NAD抑制剂FK866分别溶于生理盐水中,配制成5%浓度的溶液。TBI+NAD组、TBI+TTM+NAD组和TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组大鼠按照500mg/kg体质量的剂量,于造模后第二天起每日8时和18时腹腔注射NMN,连续7天,另两组TBI大鼠于同一时间注射同等剂量的生理盐水,TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组于腹腔注射NMN后1h后,腹腔注射FK866,40mg/kg。TBI+TTM组、TBI+TTM+NAD组和TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组在TBI后行TTM治疗,具体方法如下:将亚低温治疗仪连接后,设定冰毯温度为7℃,时程设定为6h,在TBI后10分钟,将大鼠置于冰毯上,约20分钟后肛温达到33℃-34℃后,每间隔30分钟测一次温度以保持体温维持在亚低温水平。治疗结束后,将大鼠放入室温环境以缓慢复温。于最后一次腹腔注射操作后的12h,进行行为学评分,包括网屏实验和改良神经功能损伤评分。待上述实验完成后,颈椎离断法处死大鼠,每组随机选取3只大鼠,取出脑组织并去除延髓及以下部分测脑组织含水量。每组大鼠中另取3只,切取损伤侧同一部位组织标本,分别称取重量50mg,酶联免疫吸附法检测NAD、丙二醛、肿瘤坏死因子-α。另取损伤侧同一部位脑组织约5mg并置于1.5ml无菌离心管内,提取组织DNA和总RNA。Real-time PCR法计算线粒体拷贝数,以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)、PGC-1β、过氧化物酶体增生物激活受体δ(PPARδ)、核呼吸因子-1(NRF1)、NRF2、线粒体转录因子-A(TFAM)、B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)和bax基因的相对表达量。Western blot法检测S100β蛋白、水通道蛋白4(AQP4)、紧密桥接蛋白(TJPs)。免疫荧光法检测胶质细胞内受体相互作用蛋白1(RIP1)的表达情况。3.取5只SD大鼠,取出骨髓,利用全骨髓贴壁培养法分离并培养骨髓间充质干细胞。随后利用家蚕生丝制备丝素蛋白溶液,将壳聚糖和透明质酸分别溶于醋酸溶液中,制成2%壳聚糖溶液,和2%透明质酸溶液,按照丝素蛋白:壳聚糖:透明质酸=2:4:1的比例配置混合液,用磁力搅拌棒充分混匀后,将混合液移入铸模中,设置3D打印机参数,经冷冻干燥制作出固体模型。采用无水乙醇液体置换法,测量复合支架的孔隙率,应用Instron5865软件,通过绘制应力与应变相对变化曲线得出弹性模,将三维支架切割成为0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的正方体,与生长相对良好的第3代骨髓间充质干细胞细胞悬液共培养,并加入成骨诱导分化培养液,成骨诱导约7天后用扫描电子显微镜下观察支架及其中细胞生长情况。另取5块96孔板,每板使用8孔,其中在4孔内预先放入支架。取生长相对良好的第3代骨髓间充质干细胞,按照3000个/孔的密度,每孔内加入骨髓间充质干细胞细胞悬液150μl/孔,每隔日取出一板细胞,MTT法测细胞生长曲线。取诱导培养14 d后的两组细胞,茜素红染色法检测矿物结节,real-time PCR法检测骨桥蛋白、骨钙素和I型胶原等成骨相关基因表达水平的变化。结果:1.随着打击速率及打击深度的增加,神经功能损伤评分整体呈上升趋势,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P0.05);网屏实验评分方面,除V1组外,其余各组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05);D3组的网屏实验评分虽略高于D2组,但差异无统计学意义(P0.05);D1与D2组比较,差异亦无统计学意义(P0.05);旷场试验评分中,水平得分方面,与对照组比较,V3组以及D1至D3组得分降低,差异有统计学意义(P0.05),而D1、D2、D3三组间比较差异无统计学意义(P0.05)。垂直得分中,与对照组比较,模型组得分降低,差异均有统计学意义(P0.05),虽然随着损伤程度的逐渐加重,得分整体呈降低趋势,但V1与V2比较,以及V2至D2组之间的差异均无统计学意义(P0.05)。大便粒数方面,各组间差异均无统计学意义(P0.05);脑含水量方面,各TBI组大鼠脑含水量随着损伤严重程度的增加,整体呈增高趋势,V2至D3组与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05),但V3组与D1组比较差异无统计学意义,D1组与D2组比较,差异亦无统计学意义(P0.05)。2.与对照组比较,TBI后各组大鼠的神经功能损伤评分均显著升高,而应用NAD及TTM后神经功能损伤评分显著降低,两者连用降低程度更为明显(P0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的网屏实验评分均显著升高,而单独应用NAD或TTM,以及NAD与抑制剂合用后评分虽有降低趋势,但差异无统计学意义(P0.05),NAD与TTM合用可显著降低(P0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的脑含水量均显著升高;而与TBI组比较,应用NAD或TTM后,脑含水量显著降低,NAD与TTM合用后,脑含水量进一步降低,差异有统计学意义(P0.05),腹腔注射NMN后,TBI+NAD组和TBI+TTM+NAD组大鼠脑组织中NAD含量均显著高于未注射NMN组的大鼠,差异有统计学意义(P0.05);免疫荧光结果显示,大鼠损伤侧脑组织可见细胞质内RIP1均有表达,正常组大鼠脑组织几乎不可见RIP1阳性细胞。而与TBI组相比,应用TTM后组脑组织中RIP1阳性细胞数均能够显著降低,NAD与TTM合用组阳性细胞数降低更加明显,差异有统计学意义(P0.05)。但单独应用NAD组与TBI组相比,差异无统计学意义(P0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的脑组织中丙二醛、肿瘤坏死因子-α、S100β、AQP4和TJPs蛋白表达显著升高;而与TBI组比较,应用NAD或TTM后,S100β、AQP4蛋白表达显著降低,NAD与TTM合用后,丙二醛、肿瘤坏死因子-α、S100β、AQP4和TJPs蛋白表达进一步降低,差异有统计学意义(P0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的脑组织中线粒体拷贝数增加,PGC-1α、PGC-1β、PPARδ、NRF1、NRF2、TFAM和bax基因转录水平升高,bcl-2转录水平减低;而与TBI组比较,应用NAD后,线粒体拷贝数进一步增加,PGC-1α、PGC-1β、PPARδ、NRF1、NRF2、TFAM基因转录水平升高;NAD与TTM合用后,与单独应用TTM或NAD组及加用NAD抑制剂组相比,线粒体拷贝数进一步增加,PGC-1α、PPARδ、NRF2、TFAM和bcl-2基因转录水平升高,bax转录水平减低,差异有统计学意义(P0.05),单独应用TTM组以及NAD抑制剂组与TBI组相比,bcl-2基因转录水平升高bax转录水平减低(P0.05),但线粒体生物合成相关基因表达差异无统计学意义(P0.05)。3.提取分离到的骨髓间充质干细胞浓度较大,在显微镜下,可见细胞呈圆形,胞浆较丰满,呈细沙状悬浮在培养基中。骨髓间充质干细胞在培养过程中,大约24小时即可呈现贴壁生长状态,生长较为缓慢。换液后细胞的增殖情况明显增强,出现梭形为主的多种细胞形态。12天时细胞形态较单一,多呈梭形、漩涡状和放射状排列。丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架可见支架表面较光滑,表面可见平均直径为200-250μm的孔隙,分布均匀,且相互连通,孔壁厚度约6μm。5块丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架的孔隙率测量结果为30.13±4.40%。该复合支架质地较为坚韧,浸泡PBS后略变软,形态具有延展性和可复性。复合支架压缩模量为(12.53±1.69)k Pa。扫描电子显微观察显示,复合支架呈多层立体结构,支架表面及支架内部可见附着较多骨髓间充质干细胞,呈串珠状,MTT法检测骨髓间充质干细胞的增值情况,可见培养初期细胞生长速度较为缓慢,在前3天属于生长滞缓期。从第6天起,细胞的增殖速度明显增快,提示细胞此时已经适应培养基的环境,属于指数生长期。吸光度值在细胞培养第8天时达到高峰,随即变平稳,属于细胞生长平台期,此生长曲线也较好的反映了骨髓间充质干细胞生长的周期特点,且两组细胞的增殖趋势一致,差异无统计学意义(P0.05)。两组骨髓间充质干细胞经过成骨诱导培养2周后,用茜素红进行染色,微镜下可见橘红色沉淀,即茜素红染色阳性,表明骨髓间充质干细胞成功向成骨细胞表型进行了分化。在接种两周后,可见与复合支架共培养的骨髓间充质干细胞的骨钙素、骨桥蛋白、及I型胶原基因转录水平均显著高于正常培养的细胞,两组之间差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1.在固定打击最低点持续时间均为200毫秒的情况下,以2mm的打击深度,4 m/s的打击速度构建轻度TBI大鼠模型,以2mm的打击深度,5 m/s的打击速度构建中度TBI大鼠模型,以4mm的打击深度,5m/s的打击速度构建重度TBI大鼠模型,具有较好的成功率和区分度,该参数更为适合构建不同损伤程度的TBI大鼠模型。2.在重度TBI后,应用NAD可显著促进线粒体的生物合成,从而提高脑组织的能量供应,改善神经功能。TTM的应用可有效抑制细胞的凋亡,并给予受损脑组织更长的修复时间窗。两者合用可发挥相互协同作用,进一步降低炎症及氧化应激水平,降低血脑屏障通透性,减轻脑水肿,从而发挥神经保护作用,这也为日后的临床治疗TBI提供了新策略。3.本实验通过全骨髓贴壁培养法分离并培养出了骨髓间充质干细胞,实验结果提示细胞纯度较高、细胞活性较强,作为骨组织工程中的种子细胞较为适宜。通过3D打印技术构建的丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架,具有良好的生物相容性、机械性能以及多孔性,复合骨组织工程对支架理化性质的要求,同时该支架还可上调成骨相关基因的转录,促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,这也为骨组织工程修复骨缺损提供了潜在的治疗选择,应用前景良好。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.15
【图文】：

模型构建

（C group）。手术开始前，每只大鼠均组腹腔注射青霉素 10 万单位，随 5%水合氯醛，按每千克给予 7ml 的剂量将模型组大鼠麻醉。大鼠颅顶剃后剪开皮肤，暴露右侧顶骨，以前囟向后 3 毫米，矢状缝右侧旁开 2.5 毫心，取一直径约 5 毫米圆形，用手术刀片清理暴露区域内颅骨表面的软开骨窗之后固定大鼠于打击平台之上。将脑皮质撞击仪的打击臂角度调垂直方向呈 20°，使打击平面与脑皮质的表面保持平行，选用 3mm 打击打击大鼠的大脑皮层。打击参数如下：V 组的打击最低点持续时间均为，打击深度均为 2mm，V1、V2 和 V3 组的打击速率分别为 3 m／s 、4 和 5 m／s；D 组的打击最低点持续时间均为 200 毫秒，打击速率(veloc 5 m／s ，D1、D2 和 D3 组打击深度分别为 3mm、4mm、5mm。打击后肤。见图 1。对照组正常饲养不进行额外操作。若出现术后死亡大鼠则进的增补。评分人员首先经过相关培训，于造模后 48h，在不知分组情况的，对大鼠神经功能进行相应的评分。

颅脑创伤,对照组,大鼠模型,博士学位论文

医科大学博士学位论文一、脑皮质撞击法构建颅脑创伤大鼠模型中果各组存活情况D2 组在术后 48h 内死亡 2 只，D3 组在术后 48h 死亡 4 只。神经功能损伤评分随着打击速率以及打击深度的增加，神经功能损伤评分整体照组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.05），见图 2。

网屏,大鼠,对照组

图 3 各组大鼠的网屏实验得分比较 *：与对照组旷场试验结果各 TBI 模型组中，水平得分方面，V3 组以及 D1 至 D，差异均有统计学意义（P<0.05），D1 至 D3 三组之间比P>0.05）。垂直得分方面，对照组比较模型组均降低，差<0.05），虽然随着损伤程度的逐渐加重，得分整体呈降低，以及 V2 至 D2 组之间的差异均无统计学意义（P>0.0间差异均无统计学意义（P>0.05），见图 4。

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