Calpain在脂毒性心肌病中作用机制及运动保护效果的研究

发布时间：2019-01-25 07:55

【摘要】：研究目的:随着肥胖和2型糖尿病人群的逐年增加,与脂毒性相关的心血管疾病引起人们普遍关注。脂毒性心肌病属于慢性病理改变,就其发病机制的认识仍十分缺乏。本研究集中探索calpain蛋白水解酶在脂毒性心肌病中的作用,从内质网应激,心肌细胞凋亡和促炎因子等方面讨论抑制calpain产生对抗脂毒性心肌病的机制。研究还进一步探讨运动改善脂毒性心功能紊乱是否通过影响calpain活性而产生保护效益,为预防和治疗脂毒性心肌病提供理论和实验依据。研究方法:心肌细胞特异性Capn4基因敲除(Capn4 KO)小鼠及其野生型同窝小鼠(雄性,6周龄,n=6)喂食普通饲料或高脂饲料(60%能量来自脂肪)20周,诱导脂毒性心肌病动物模型。造模结束后,开展葡萄糖耐量和胰岛素耐受测试检查胰岛素敏感性。应用超声心动图技术评价小鼠心脏收缩和舒张功能。获取血清分析甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白浓度。计算心重/胫骨长度比评估整体水平心脏肥大。心肌组织包埋切片后,采用采用天狼猩红-饱和苦味酸染色,观察胶原纤维沉积;胚凝集素-Hochest荧光染料染色后观察心肌细胞大小。采用RT-PCR技术分析心肌组织mRNA表达,包括检测纤维化特征基因collagen-I和collagen-III,肥大特征基因ANP和β-MHC,促炎因子基因TNF-α和IL1β。分析心肌组织caspase-3活性反映心肌细胞凋亡情况。应用Western blot技术检测内质网应激相关蛋白CHOP,BIP和磷酸化JNK的表达。培养乳鼠心肌细胞,以棕榈酸(0.2 mM)处理24h,形成细胞水平水平脂毒性模型,检测DNA断裂片段和caspase-3活性评价心肌细胞凋亡。使用calpain抑制剂III和siRNA(capn1和capn2)分别抑制calpain酶活性或蛋白表达,也应用内质网应激抑制剂抑制内质网应激,共同观察calpain参与脂毒性心肌细胞凋亡的作用。促炎因子采用RT-PCR技术检测。Western blot技术检测内质网应激相关蛋白表达。C57小鼠(雄性,6周龄,n=6)分为四组:高脂饮食对照组(20周高脂饮食),高脂饮食锻炼组(20周高脂饮食+8周游泳运动),普通饮食对照组和普通饮食锻炼组。四组静养12周后,运动组开始游泳。小鼠进行每周5天,每天30分钟游泳运动,持续8周。锻炼结束后分析心功能,检测血清脂质和心肌组织calpain酶活性。研究结果:1高脂饮食20周后,野生型和capn4ko小鼠均表现出体重明显增加,血浆中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平升高,葡萄糖耐量受损。2与喂食普通饲料野生型小鼠比较,高脂饮食野生型小鼠心脏收缩功能指标射血分数(ef)和短轴缩短率(fs),心脏舒张功能指标e/a比值及冠脉血流量均显著下降。但是与高脂饮食野生型小鼠比较,高脂饮食capn4ko小鼠这些指标均得以改善。与普通饲料野生型小鼠比较,高脂饲料野生型小鼠心肌中calpain活性升高;capn4敲除后降低了高脂诱导的calpain活性增加。3在野生型小鼠中,高脂饮食小鼠的心重/胫骨长度比值高于普通饮食小鼠,形态学分析也发现心肌细胞横截面积增大;而在capn4敲除后减少了这些心肌肥大表现。此外,capn4ko正常化高脂饮食诱导的心脏肥大特征基因(anp,β-mhc))的表达。类似的,脂毒性诱导心脏出现总胶原,1型胶原和3型胶原沉积增加,而capn4ko小鼠减少了这些胶原的沉积。与此一致,纤维化特征基因(collagen1,collagen3)在capn4ko小鼠心脏中表达也低于高脂野生型小鼠。4高脂饮食显著升高心肌组织中内质网应激相关蛋白chop,bip以及磷酸化jnk1/2d的蛋白水平,而敲除capn4降低高脂饮食引起的内质网相关蛋白水平的升高。5在培养乳鼠心肌细胞中,棕榈酸能激活calpain,诱导caspase-3活性和dna断裂片段增加,同时也升高chop,bip以及磷酸化jnk蛋白表达水平;而通过calpain抑制剂iii或capn1sirna抑制calpain均能降低内质网相关蛋白表达,最终减少心肌细胞凋亡。6游泳运动显著降低了高脂饮食引起的小鼠体重,lee’s指数,血清中甘油三酯和总胆固醇水平的增加。7游泳运动显著降低了高脂饮食导致的calpain活性增加。运动改善了高脂诱导的小鼠心脏功能紊乱。结论:1高脂饮食成功诱导脂毒性心肌病表型。心肌细胞capn4敲除减缓脂毒性心肌病。2抑制calpain活性通过减弱内质网应激和炎症反应途径,减少毒性脂质诱导的心肌细胞凋亡,最终提高心功能。3抑制calpain-1而不是calpain-2,可以通过内质网应激途径减少棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡。4 calpain酶活性的减少可能是游泳运动改善脂毒性心肌功能紊乱的机制之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：G804.2

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本文编号：2414950