FUNDC1在运动诱导骨骼肌线粒体自噬中的作用机制

发布时间：2020-03-22 22:06

【摘要】：研究目的:建立电脉冲刺激模型,观察电脉冲刺激对C2C12细胞中线粒体结构、功能和自噬的影响,通过蛋白印迹法、免疫荧光等实验技术探讨电脉冲刺激对骨骼肌C2C12细胞中线粒体自噬的机制及FUNDC1在其中的作用。研究方法:C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞珠复苏,传代培养2-3代,分为对照组(C)、DMSO组(D)、AICAR组(A)、Compound C组(Co)、FK506组(F)、电脉冲刺激组(E)、电脉冲刺激+Compound C组(E+Co)、电脉冲刺激+FK506组(E+F),干预后收集细胞并进行检测。检测线粒体定量酶CS含量、生物链复合体COX-I蛋白、生物合成标志PGC-1α蛋白,分析线粒体数量、功能的变化;通过Western blot检测AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ULK1、p-ULK1(Ser555)蛋白表达,分析能量代谢指标的变化;通过免疫荧光分别观察LC3/COXIV、LC3/FUNDC1、FUNDC1/COXIV共定位情况;通过Western blot印迹检测线粒体自噬相关蛋白LC3、p62、FUNDC1、PGAM5的表达,并验证FUNDC1在其中的作用。实验数据采用单因素方差分析处理。研究结果:(1)15V,1Hz,2ms、1h电脉冲刺激(EPS)不会引起C2C12细胞内线粒体定量酶CS含量增加(p0.05);会引起线粒体生物合成蛋白PGC-1α、呼吸链复合体COX-I蛋白表达显著增加(p0.05);引起自噬相关蛋白LC3表达显著增加和p62蛋白表达显著减少(p0.05)。(2)浓度6uM的FK506在24h时不会降低FUNDC1蛋白表达(p0.05),在48h和72h时可以降低FUNDC1蛋白表达(p0.01),48h时细胞活性较高。(3)通过使用FK506抑制FUNDC1蛋白可引起其磷酸酶PGAM5及自噬相关蛋白LC3表达下降,p62表达增加,引起FUNDC1/COXIV和LC3/FUNDC1免疫荧光共定位的水平降低;EPS可引起FUNDC1和LC3蛋白表达显著增加,p62蛋白表达显著降低(p0.05),免疫荧光双染LC3/COXIV、FUNDC1/COX-IV、LC3/FUNDC1共定位的水平均显著升高(p0.01);EPS后给予FK506干预仍可显著升高FUNDC1、LC3蛋白表达,降低p62蛋白表达(p0.05),提高免疫荧光双染LC3/COXIV、FUNDC1/COXIV、LC3/FUNDC1共定位水平(p0.01),但蛋白及免疫荧光结果表达低于EPS作用效果。(4)AMPK激活剂AICAR可使PGC-1α、COX-I蛋白表达显著升高(p0.05),使AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、p-ULK1(Ser555)、LC3、p62蛋白表达升高,使LC3/COXIV共定位水平略有下降(p0.05);EPS可使PGC-1α、COX-I、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ULK1、p-ULK1(Ser555)、FUNDC1、LC3表达显著升高,p62蛋白表达显著下降(p0.05),显著提高LC3/COX-IV、FUNDC1/COX-IV、LC3/FUNDC1共定位水平(p0.01);EPS+Compound C可使AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ULK1、p-ULK1(Ser555)、FUNDC1、LC3表达显著升高,COX-I、p62蛋白表达显著下降(p0.05),PGC-1α蛋白表达略有升高,并显著升高LC3/COXIV、FUNDC1/COXIV、LC3/FUNDC1共定位水平(p0.05)。研究结论:(1)电脉冲刺激C2C12细胞模拟运动能够诱导线粒体自噬(2)FK506可以有效的降低FUNDC1蛋白的表达(3)电脉冲刺激通过激活AMPK—ULK1通路模拟运动诱导线粒体自噬的发生(4)FUNDC1通过AMPK—ULK1途径参与电脉冲刺激诱导的线粒体自噬。
【图文】：

图 2.1 FUNDC1 在低氧和饥饿条件下的调控机制动力学机制中，线粒体定位的 RING-finger E3 连接酶rane-associatedringfinger(C3HC4)5，MARCH5）是一3 连接酶，通过两种途径抑制线粒体的分裂：（1）DNM和裂变受体 FIS1 和 MIEF2 的降解抑制线粒体 DNM15 能够通过特异性诱导 FUNDC1 降解在线粒体形态和赖氨酸 119（K-119）在低氧条件下对 FUNDC1 的泛素寡聚体，促进其与 FUNDC1 的相互作用，应对在线粒伤。随着缺氧时间的延长，FUNDC1 残基会经历去磷的泛素化和 FUNDC1 的降解，预防发生过度或突发的粒体的正常功能。 与运动诱导线粒体自噬的关系

并在Ser17位点处磷酸化，增强与LC3之间的相互作用，并且在ULK1和FUNDC结合缺陷的突变体细胞中发现，ULK1 转位到线粒体以及线粒体自噬受到影响[86此外，去表达的 Atg5 蛋白减少了 FUNDC1 介导的线粒体内膜蛋白 TIM23，并降低了 LC3-I 到 LC3-II 的转化，表明 FUNDC1 可以依赖 Atg5 介导的线粒体自噬。去表达 BECN1 也抑制饥饿和 mTOR 诱导的自噬[87,88]，而去表达的 BECN1 并不影响 FUNDC1 诱导的线粒体自噬[89]。
【学位授予单位】：北京体育大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：G804.2

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本文编号：2595695