模拟微重力环境中肺炎克雷伯菌重要生理表型变化及其潜在机制研究

发布时间：2017-09-03 16:14

  本文关键词：模拟微重力环境中肺炎克雷伯菌重要生理表型变化及其潜在机制研究

  更多相关文章： 模拟微重力 肺炎克雷伯氏菌 表型异质性 生物被膜 抗菌药物敏感性

【摘要】：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是一种广泛存在于自然界及宿主体内的革兰阴性机会致病菌,在哺乳动物中该菌主要定植于宿主肠道、呼吸道及生殖泌尿道黏膜表面。当前肺炎克雷伯氏菌主要引起住院患者的院内感染,包括呼吸道、尿道、血液及伤口感染等。在亚洲部分地区,肺炎克雷伯氏菌是引发患者肝脓肿的主要病原体,并可继发引起眼内炎、脑膜炎等一系列严重并发症。此外,肺炎克雷伯氏菌抗菌药物耐药性问题日趋严重,特别是伴随ESBLs及碳青霉烯类耐药菌株的出现及流行,临床治疗该菌相关感染的药物选择极为有限。航天飞行中航天员免疫系统功能受抑,而在轨航天器内部环境及航天员体内也曾检出肺炎克雷伯氏菌,对航天飞行中航天员的健康构成潜在的威胁。微重力是太空环境的主要特点之一,但受限于实验资源的稀缺性,真实微重力环境中进行细菌致病性及耐药性研究机会极少。因此,基于地面模拟微重力技术的微生物研究必将为太空相关研究提供有益的补充和确证。借助于旋转细胞培养系统(RCCS)及高截面比培养皿(HARV)的广泛应用,本研究以肺炎克雷伯氏菌ATCC BAA-1705为实验对象,在正常重力或模拟微重力环境中平行培养该菌,观察其多种生理特性(生物被膜形成、毒力及抗菌药物敏感性等)的改变,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)、定量蛋白质组学技术结合传统分子生物学技术,探究相关表型变化可能的分子机制。本研究将两台RCCS设置为模拟微重力(SMG)及正常重力(NG)两种工作模式,每24 h分别在两组中传代培养肺炎克雷伯氏菌,实验周期为2周。培养过程中应用光学或电子显微镜连续监测两组中细菌菌落和菌体形态的变化;培养结束后取出培养物观察两组中肺炎克雷伯氏菌生理特性的改变,如利用菌落形态及结晶紫实验生物被膜形成情况,利用刚果红和Calcofluor染色、纤维素酶消化和酵母细胞凝集等实验对肺炎克雷伯氏菌纤维素与III型菌毛的合成情况进行定性及定量观察。在此基础上进行小鼠攻毒实验,观察两组中肺炎克雷伯氏菌致病性差异。采用系列稀释菌液涂布平板的方法分离呈现表型异质性生长的肺炎克雷伯氏菌亚群菌株,同样分析了亚群菌株间生物被膜形成、纤维素与III型菌毛的合成、小鼠毒力及抗菌药物敏感性等表型差异。通过高通量组学研究手段(如RNA-seq、定量蛋白质组分析等)及qRT-PCR等实验分析重要表型相关基因表达在转录和翻译水平上的差异。经过2周的连续传代培养,本研究发现SMG组与NG组肺炎克雷伯氏菌均呈现出表型异质性的生长特点,形态学表现为长链状菌体的生成。与NG组比较,smg组肺炎克雷伯氏菌生物被膜形成能力增强,小鼠毒力增强(腹腔注射107cfu细菌,14天观察期内smg组小鼠死亡率为50%,而ng组无小鼠死亡),与生物被膜相关的纤维素及iii型菌毛合成与表达也显著升高。转录组测序显示smg组肺炎克雷伯氏菌覆盖基因组不同位置的171个基因表达发生变化,89个基因表达上调,82个基因表达下调,经kegg分析88个差异表达基因可归类为15个功能通路,主要涵盖物质代谢及信号转导通路。rna-seq与qrt-pcr均证实smg组肺炎克雷伯氏菌iii型菌毛编码基因(mrkabcdf)及其正向调控子编码基因(mrkh)表达水平均为ng组对应基因的两倍以上。此外,本研究进一步分析了肺炎克雷伯氏菌生长过程中的表型异质性。第2周培养结束时,smg组或ng组培养物中均可分离得到4种肺炎克雷伯氏菌亚群菌株(命名为m1、m2、m3及m4),但两组中亚群菌株构成比例有不同之处。smg组m1亚群占比最高(79.6%),其次为m3亚群(17.9%),m2占比最低(2.5%);ng组大多数亚群菌株为m3(69.6%),其次为m1(29.8%),m2占比同样最低(0.6%)。m4菌株在两组中极为罕见,占比忽略不计。形态学观察发现m1亚群细胞周围有荚膜,m2、m3及m4亚群细胞周围均无荚膜存在,m2亚群细胞串联排列形成链状菌体结构。表型实验显示m2亚群生物被膜形成能力相对最强,m4亚群次之,而m1及m3亚群几无生物被膜形成能力。纤维素生成分析结果显示与生物被膜形成密切相关的纤维素主要由m2亚群合成及表达,其他亚群无纤维素生成或生成量极低;rna-seq结果证实,相对于m1亚群纤维素合成基因的表达水平,smg环境中m2亚群中纤维素合成核心酶编码基因bcsa1及bcsa2表达显著上调,其他纤维素合成相关基因中bcsc2与bcsd表达同样显著上调,而bcsz2表达显著下调。透射电镜观察显示,smg环境中肺炎克雷伯氏菌4种亚群均可形成iii型菌毛;而甘露糖抵抗的酵母细胞凝集实验显示m1亚群iii型菌毛形成最多,m2及m3亚群次之,m4亚群最少,与rna-seq结果一致。小鼠毒力实验中(腹腔注射107cfu细菌),smg环境中培养的m1亚群毒力相对最强(14天观察期内小鼠死亡率为75%),其他亚群同等菌量攻毒后观察期内均未引起小鼠死亡。抗菌药物敏感性实验结果显示m2亚群对β-内酰胺类抗菌药物敏感性增强,其他亚群菌株对该类抗菌药物敏感性无明显变化;qrt-pcr证实与m1亚群对应基因相比,m2亚群中kpc-2型碳青霉烯酶编码基因blakpc-2表达显著降低,而其耐药相关的外膜孔蛋白编码基因(ompk36)及外排泵编码基因(acrab)表达无明显变化。此外,定量蛋白质组学研究显示,相对于m1亚群,m2亚群157个蛋白表达发生显著变化,其中36个蛋白表达显著增多,121个蛋白表达显著减少。其中M2亚群KPC-2型碳青霉烯酶表达显著降低(为M1亚群0.21倍),而外膜孔蛋白及外排泵相关蛋白表达无明显变化,与qRT-PCR一致。上述结果证实碳青霉烯酶表达下降是M2亚群对β-内酰胺类抗菌药物敏感性增强的主要原因。SMG环境中肺炎克雷伯氏菌生物被膜形成能力增强与其纤维素及III型菌毛合成及表达增多密切相关,小鼠毒力增强与该环境中毒力较强的M1亚群比例更高相关。为适应SMG环境,肺炎克雷伯氏菌呈现表型异质性的生长特点,及最初菌株可分化产生生理特点差异较大的亚群菌株。M2亚群串联排列的链状菌体显示出细菌间相互黏附的多细胞行为;纤维素对维持M2亚群菌体间相互黏附及生物被膜形成有重要作用;本研究中KPC-2型碳青霉烯酶编码基因由质粒携带,M2亚群中该酶表达水平降低可能与质粒拷贝数下降有关,其具体机制值得进一步研究。本研究旨在探索模拟微重力条件下肺炎克雷伯氏菌重要生理特性的改变及其相关机制,验证并补充现有空间微生物学领域的相关研究成果,预测可能病原细菌的空间变异趋势,为研究空间环境下肺炎克雷伯氏菌的变异机制研究提供了研究思路和技术平台。同时,为深入研究肺炎克雷伯氏菌的地面感染机制提供有潜在价值的靶标。
【关键词】：模拟微重力 肺炎克雷伯氏菌 表型异质性 生物被膜 抗菌药物敏感性
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R85
【目录】：

• 英文缩略语5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-20
• 1. 空间环境中存在感染性疾病发病风险12
• 2. 肺炎克雷伯氏菌流行病学特点及生物学特征12-14
• 3. 模拟微重力设备特性及应用14-15
• 4. 微重力或模拟微重力环境中细菌生理变化研究概况15-16
• 5. 本研究特点及创新性16-17
• 参考文献17-20
• 第一部分 模拟微重力环境中肺炎克雷伯氏菌生物被膜形成及毒力变化研究20-43
• 1. 引言20-22
• 2. 技术路线22-23
• 3. 材料23-24
• 3.1. 实验菌株23
• 3.2. 试剂与溶液23-24
• 3.3. 主要仪器与耗材24
• 4. 方法24-31
• 4.1. 细菌培养24-25
• 4.2. 肺炎克雷伯氏菌菌体观察25
• 4.3. 生物被膜形成能力评价25-26
• 4.4. 酵母细胞及豚鼠红细胞凝集试验26-27
• 4.5. 小鼠毒力实验27
• 4.6. 转录组学分析27-28
• 4.7. qRT-PCR验证28-30
• 4.8．统计学分析30-31
• 5. 结果与讨论31-40
• 5.1. SMG组与NG组肺炎克雷伯氏菌菌体观察31-32
• 5.2. SMG组与NG组肺炎克雷伯氏菌生物被膜形成差异32-33
• 5.3. SMG组与NG组肺炎克雷伯氏菌纤维素生成分析33-34
• 5.4. SMG组与NG组肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表达分析34-35
• 5.5. 小鼠毒力实验结果35-36
• 5.6. 转录组测序结果36-39
• 5.7. qRT-PCR验证结果39-40
• 6. 小结40-41
• 参考文献41-43
• 第二部分肺炎克雷伯氏菌表型异质性研究43-69
• 1. 引言43-44
• 2. 技术路线44-45
• 3. 材料45-46
• 3.1. 实验菌株45
• 3.2. 主要试剂与试剂盒45-46
• 3.3. 主要仪器与耗材46
• 4. 方法46-51
• 4.1. 亚群菌株分离、鉴定与形态观察46-47
• 4.2. 亚群菌株生物被膜形成能力评价47
• 4.3. 亚群菌株纤维素生成分析47-48
• 4.4. 亚群菌株III型菌毛表达分析48
• 4.5. 亚群菌株抗菌药物敏感性实验48-49
• 4.6. 亚群菌株小鼠毒力实验49
• 4.7. qRT-PCR检测亚群菌株基因表达差异49-50
• 4.8. 定量蛋白质组学技术分析M1亚群与M2亚群蛋白表达差异50
• 4.9. 统计学分析50-51
• 5. 结果与讨论51-64
• 5.1. 亚群菌株分离与鉴定结果51-53
• 5.2. 亚群菌株形态观察53-56
• 5.3. 亚群菌株生物被膜形成能力评价56
• 5.4. 亚群菌株纤维素生成分析56-57
• 5.5. 亚群菌株III型菌毛表达分析57-58
• 5.6. 亚群菌株药敏实验结果58-59
• 5.7. 亚群菌株小鼠毒力实验59-60
• 5.8. qRT-PCR结果60-63
• 5.9. 定量蛋白质组学分析结果63-64
• 6．小结64-66
• 参考文献66-69
• 附表69-84
• 个人简历84-85
• 致谢85-86

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