毛栓菌漆酶分离纯化、介体系统及污染降解应用

发布时间：2020-03-18 04:36

【摘要】：漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一种含有多个Cu~(2+)的多酚氧化酶,其广泛存在于真菌、细菌、高等植物及昆虫中。漆酶可以催化芳香类等物质的降解,如木质素、染料和农药等。由于一些环境化合物的氧化还原电势高于漆酶,因此限制了漆酶的降解应用。介体的发现使漆酶的作用范围扩大、降解速率提高,漆酶/介体系统(LMS)可以降解非酚类及氧化还原电势高的化合物,因此,漆酶在木质素降解和环境污染物的降解等方面有着潜在的应用价值。本文以实验室野外采集的26种真菌菌株为材料,筛选获得具有高效耐受农药的菌株(BUA-01),并以BUA-01为实验出发菌株,研究其菌株培养及产酶条件、胞外漆酶分离纯化、酶学特性和基因克隆以及LMS对污染物的降解应用研究。具体内容如下:1、以吡虫啉(0.5%)、乙酰甲胺磷(0.2%)、草甘膦异丙胺盐(0.4%)和高效氯氰菊酯(2.2%)为作用靶标,对26种真菌开展农药高耐受菌筛选,得到BUA-01菌株,其在上述四种农药培养基中的生长速率分别是6.75±0.25 mm/d、5.25±0.00 mm/d、3.25±0.13 mm/d和4.67±0.26 mm/d。结合形态学特征观察及ITS分子鉴定,确定此菌株为毛栓菌(Trametes hirsuta);BUA-01最适培养条件:淀粉为最适碳源,黄豆粉和酵母浸粉为最适氮源,最适C/N比为40/1和10/1,最适温度为37℃,最适pH为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用;培养基中Cu~(2+)浓度为0.25 mmol/L,在培养96 h时,发酵液的漆酶活性达到最高,是对照组的26倍,为1081.33±6.3U/mL;BUA-01菌株发酵液对偶氮染料降解效果显著,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31±0.16%、92.37±0.42%和79.25±0.64%。2、以5%的接种量将BUA-01菌株接种到终浓度为0.25 mM Cu~(2+)的发酵培养基中,28℃、180rpm振荡培养3 d后,获得粗酶液。依次通过DEAE-Sepharose、SP-Sepharose和Q-Sepharose离子交换层析技术,获得电泳纯级的漆酶(THL),经SDS-PAGE,确定其分子量为67.7 kDa;以ABTS为作用底物时,漆酶的最适温度为60℃;最适pH为2.2;在温度和pH分别在50-65℃和4.2条件下稳定性较高;K_m与V_(max)分别为28.44μM和555.56μmol/min;10.0 mM Mg~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Cd~(2+)、Co~(2+)和EDTA对漆酶有显著的抑制作用,抑制率25%-58%;而1.25 mM的Na~+对漆酶具有微弱激活作用,酶活提高10%左右;1.25-10.0 mM K~+对漆酶的活性无显著影响。通过以简并引物对漆酶保守序列进行扩增,获得长度为1226 bp的漆酶核心区cDNA部分序列,与T.hirsuta(KU878364.1)的相似性为97%,遗传距离为0.072。3、LMS研究表明,该漆酶的最适介体为乙酰丁香酮(AS)和四甲基哌啶氮氧化物(TEM);LMS对碱性品红、甲基橙、孔雀石绿和依文思蓝降解效果最佳,24 h的降解率最高分别为72.3%、86.1%、88.2%和89.2%;全波段扫描结果表明,介体AS比介体TEM更具有提高漆酶反应速率的能力,且THL-AS和THL-TEM在降解碱性品红、甲基橙和依文思蓝染料过程中均有新物质生成;pH、温度和介体浓度对LMS的影响表明,THL-AS在pH 2.0-5.0,20-60℃,介体浓度为0.1 mM的条件下非常稳定,在1 h可实现对染料的高效降解,降解率可达80%左右;THL-TEM在pH 3.0-4.0,50-60℃,介体浓度为0.5-1.0 mM的条件下较为稳定,但降解效率不如THL-AS高;在24 h时,THL-TEM对乙酰甲胺磷的降解效果最好,为65.56%;THL-ABTS对黄曲霉毒素B_1的降解效果最好,为20.88%;LMS反应液的10倍和50倍稀释液对黑麦草具有低植物毒性,且随着稀释倍数的增加,对根长生长的影响越小。
【图文】：

漆酶活性,中心结构

漆酶活性中心结构

氧化机制,漆酶,灰盖鬼伞,底物

化机制[17]. Substrate:底物；Substrate(+):底物chanism Substrate: Substrate; Substrate (+):Cupredoxin）型，具有三个部分的结子的特点。Ducros 从灰盖鬼伞（Cop-Cc 的结构（PDB 注册号 1A65, 图 1-
【学位授予单位】：北京农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X172

【参考文献】