Leucobacter triazinivorans sp JW-1代谢扑草净脱甲硫基酶基因克隆表达及功能研究

发布时间：2020-03-22 05:01

【摘要】：扑草净是一种广谱的三嗪类长残留除草剂,由于其大量频繁使用对土壤和地下水造成了严重污染。微生物修复是其污染去除的重要手段,以阿特拉津为代表“津”类三嗪类除草剂的微生物降解途径与分子机理已有深入地研究,但以扑草净为代表的“净”类三嗪除草剂代谢途径与功能基因研究相对较少。本论文以前期分离的一株扑草净降解菌株Leucobacter triazinivorans sp JW-1为研究对象,在明确其降解扑草净化学途径基础上,通过克隆扑草净脱甲硫基基因,构建大肠杆菌原核表达系统,His GraviTrap Co柱分离纯化重组蛋白,开展其酶学性质(温度、pH、酶反应动力学常数和底物特异性)研究,主要研究结果如下:1.通过菌株JW-1质粒测序和Blast比对分析,得到脱甲硫基可能基因序列大小为1371 bp,序列比对结果显示与Arthrobacter aurescens.TC1的阿特拉津脱氯水解酶TrzN基因序同源性达99%。2.通过克隆扑草净脱甲硫基降解基因,构建具有T7强启动子的pET-28 b+高效表达载体,转化至E.coil B21(DE3),构建了扑草净脱甲硫基酶的原核表达系统。重组蛋白His GraviTrap Co柱分离纯化后,降解功能验证和SDS-PAGE分析表明重组蛋白表达成功。纯化后蛋白酶的比活力由1.15±0.012 U/mg(粗酶液)提高到16.64±1.32 U/mg(纯化酶),纯化倍数为14.47倍,纯化后的酶活性回收率为粗酶的2.7%。3.以扑草净为反应底物,研究了扑草净脱甲硫基重组酶的酶学性质,酶最适反应温度为25℃,在4-25℃下稳定性;最适反应pH为8.0,pH在7-8之间稳定,当pH大于8或低于7时,酶活性急剧下降。4.重组酶在25℃、pH为8.0的条件下催化反应的米氏常数K_m为34μmol/L,最大反应速率V_(max)为0.22μmol/(L min),该酶可以降解西草净、敌草净、甲氧丙净、特丁净、阿特拉津和扑灭通。
【图文】：

三嗪类除草剂降解途径Figure1-1Degradationpathwayoftriazineherbicidesbymicroorganisms

月1日已禁止三嗪类除用，我国扑草净的销售据 2016 年 WBISS C为 700 吨，出口额 2,06，化学性质稳定，，不易以上[55]。扑草净在田间种植过程中扑草净施药达到 2.1kg/ha，棉花植，容易造成土壤和水体水产养殖中的凡纳滨对0.028 mg/L[58, 59]。研究表异常），神经系统异常（男性生殖系统的代谢异病增加、恶性肿瘤患者
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X592;X72;Q78

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本文编号：2594526