胡卢巴植物薯蓣皂素合成的前体路径鉴定研究

发布时间：2020-03-28 00:31

【摘要】：薯蓣皂素(Diosgenin)作为一种药用价值极高的三萜类次生代谢物,需求量极大,但传统的提取方法不仅繁琐复杂,且污染严重,合成生物学的发展,为薯蓣皂素的合成提供了新思路。目前薯蓣皂素在植物体内的合成通路尚未完全解析,其生源途径是以胆固醇(cholesterol)还是谷甾醇(sitosterol)为前体仍存在争议。药用植物胡卢巴(Trigonella foenum-graecum L.)为薯蓣皂素合成植物,本研究以来源于中国山西省的胡卢巴植物为研究材料,旨在解析薯蓣皂素的生源途径。为实现此研究目标,本论文分别从植物生理和分子生物学两个层次开展了下述实验:1、在生理方面,利用两种酶抑制剂(lovastatin和fosmidomycin)处理胡卢巴小苗,抑制其体内薯蓣皂素合成的上游通路,然后人为添加胆固醇或谷甾醇,分析它们对薯蓣皂素生物合成的影响;2、在分子层面,本研究从胡卢巴植物中分离了特异存在于谷甾醇合成途径的亚甲基转移酶(Sterol 24-C-methyltransferase1,SMT1)基因,利用基因编辑技术将其失活,从而达到谷甾醇合成阻断效果,并进一步研究此基因编辑事件对薯蓣皂素生物合成的影响。上述实验的开展取得的结果如下:1.本论文分析了胡卢巴小苗中薯蓣皂素合成的空间分布特征,发现了该成分主要积累于该植物叶器官;进一步基因表达分析显示其合成途径上下游基因呈现复杂而明显不同的组织表达特征,说明胡卢巴植物中薯蓣皂素整条链的生物合成,可能由不同植物组织共同参与协作完成。2.经磷铵霉素处理的胡卢巴幼苗,MEP(Methylerythritol pathway)途径受到抑制,薯蓣皂素含量有所提高;经洛伐他汀处理的胡卢巴幼苗,MVA(Mevalonic pathway)途径受到抑制,薯蓣皂素含量受到抑制,且抑制效果显著。因此推测:薯蓣皂素主要经由MVA途径合成。3.在洛伐他汀处理胡卢巴幼苗的第72 h时,添加胆固醇或谷甾醇,发现胆固醇可使合成受到抑制的薯蓣皂素含量有所恢复,而谷甾醇对其恢复的效果更明显;在抑制剂处理胡卢巴幼苗的同时添加胆固醇或者谷甾醇,分析薯蓣皂素的变化情况,得到了与上述一致的实验结果。所以推测:胆固醇和谷甾醇可能均为薯蓣皂素的生源物质,而谷甾醇更有可能为薯蓣皂素的主要合成前体。4.利用高通量第二代测序技术,对洛伐他汀处理胡卢巴幼苗第72 h的样品进行转录组测序,获得了 43.29 G数据,组装得到47953 Unigenes,其中37749 Unigenes得到了功能注释。根据FPKM值分析差异基因的表达,发现虽然该时间点薯蓣皂素含量受到明显抑制,但薯蓣皂素合成通路上主要基因的表达量并无显著差异,说明抑制剂是通过抑制酶活性而并非通过影响基因表达水平下调了薯蓣皂素的生物合成。5.克隆了胡卢巴中的SMT1基因,利用大肠杆菌E.coli原核表达系统,进行体外酶促反应,遗憾未能确认该SMT1的生化功能;利用CRISPRCas9基因编辑技术以及胡卢巴的发根系统,通过植物转基因,进行SMT1在薯蓣皂素合成中的功能探究,但目前阶段因尚未获取阳性发根材料,后续实验有待进行。
【图文】：

薯蓣皂素

目前关于薯蓣皂素的生物合成通路下游部分有两种推测：１．环阿逡逑屯醇经由胆固醇，最终形成薯蓣皂素。２．环阿屯醇经由谷留醇，合成薯蓣皂素，逡逑如图１．４。逡逑２，３－0ｘｉｄｏｓｑｕｌｅａｅ逡逑ｃｙｃｌｏａｒｔｅｎｏｌ逡逑？邋＼逡逑？邋＼逡逑？逦＼逡逑？逦＼逡逑ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ逦ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ逡逑＇、邋／逡逑Ｎ逦／逡逑％逦／逡逑＇建邋‘逡逑ｄｉｏｓｇｅｎｍ逡逑图１．４．推测的薯蓣皂素合成途径逡逑Ｆｉｇｌ．４．邋Ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｄｉｏｓｇｅｎｉｎ．逡逑１．５邋药用植物胡卢巴邋７Ｗｇ谓逡逑胡卢巴（７Ｗｇ（川榦－ｇｒａｅｃｗｍ邋Ｌ．），显科、胡卢巴属，为一年生的双子逡逑叶草本植物，二倍体植株（Ｐｅｔｉｔａｌｄａｎａ等，２０１４），自花传粉。茎呈绿色，圆形或逡逑者稍四边形（Ｂｌａｎｋ邋等，１９９７；邋Ｍｏｒａｄｉ邋ａｎｄ邋Ｍｏｒａｄｉ，２０１３；邋Ｓｏｗｍｙａａｎｄ邋Ｒａｊｙａｌａｋｓｈｍｉ，逡逑１９９９）；叶片呈淡绿色，被短柔毛，幼嫩时呈现淡黄色，完全成熟时为白色逡逑（Ｍｅｈｍｆａｒｉｎ等，，２０１１）；种子大多为浅棕色，长方形至椭圆形，基部和子叶之间逡逑有深凹槽，如图１．４所不（Ｂａｌｃｈ，邋２００３；邋Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，２００６）。胡卢巴分布范围广逡逑泛

种子,薯蓣皂素,环阿屯醇,自花传粉

目前关于薯蓣皂素的生物合成通路下游部分有两种推测：１．环阿逡逑屯醇经由胆固醇，最终形成薯蓣皂素。２．环阿屯醇经由谷留醇，合成薯蓣皂素，逡逑如图１．４。逡逑２，３－0ｘｉｄｏｓｑｕｌｅａｅ逡逑ｃｙｃｌｏａｒｔｅｎｏｌ逡逑？邋＼逡逑？邋＼逡逑？逦＼逡逑？逦＼逡逑ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ逦ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ逡逑＇、邋／逡逑Ｎ逦／逡逑％逦／逡逑＇建邋‘逡逑ｄｉｏｓｇｅｎｍ逡逑图１．４．推测的薯蓣皂素合成途径逡逑Ｆｉｇｌ．４．邋Ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｄｉｏｓｇｅｎｉｎ．逡逑１．５邋药用植物胡卢巴邋７Ｗｇ谓逡逑胡卢巴（７Ｗｇ（川榦－ｇｒａｅｃｗｍ邋Ｌ．），显科、胡卢巴属，为一年生的双子逡逑叶草本植物，二倍体植株（Ｐｅｔｉｔａｌｄａｎａ等，２０１４），自花传粉。茎呈绿色，圆形或逡逑者稍四边形（Ｂｌａｎｋ邋等，１９９７；邋Ｍｏｒａｄｉ邋ａｎｄ邋Ｍｏｒａｄｉ，２０１３；邋Ｓｏｗｍｙａａｎｄ邋Ｒａｊｙａｌａｋｓｈｍｉ，逡逑１９９９）；叶片呈淡绿色，被短柔毛，幼嫩时呈现淡黄色，完全成熟时为白色逡逑（Ｍｅｈｍｆａｒｉｎ等，２０１１）；种子大多为浅棕色，长方形至椭圆形，基部和子叶之间逡逑有深凹槽，如图１．４所不（Ｂａｌｃｈ，邋２００３；邋Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，２００６）。胡卢巴分布范围广逡逑泛
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;X503.23

【相似文献】