本生烟草响应铅胁迫基因的克隆及功能初步分析

发布时间：2020-04-02 08:36

【摘要】：随着工业发展,全球铅(Lead,Pb)污染成为了不容忽视的环境问题之一。铅及其化合物会对大气、土壤、水体以及动植物造成污染。研究表明,植物在逆境胁迫下为了维持细胞正常代谢或降低逆境对自身的危害,会调节特定基因的表达水平,进而产生一系列复杂的表观遗传学变化,如基因组DNA甲基化修饰,来抵抗胁迫。目前尚不清楚植物在应答铅胁迫过程中,哪些基因DNA甲基化修饰发生变化,以及这些基因如何参与调控植物应答铅胁迫。本实验室前期利用DNA甲基化敏感扩增多态性技术(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析铅胁迫对本生烟草(Nicotiana benthamiana)基因组甲基化情况,克隆了多条与DNA甲基化调控相关的基因。本论文选定其中七条基因,分别为DNA-directed RNA polymerase subunit beta(NbDDRP)、EH domain-containing protein1(NbEF)、Homogentisate phytyltransferase(NbHPT)、NADH dehydrogenase(NbNADH)、Transmembrane protein(NbTM)、V-type proton ATPase subunit F(NbVAPF)、WRKY transcription factor(NbWRKY),通过Real-time PCR(qRT-PCR)、重亚硫酸盐测序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)技术、病毒诱导的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)技术和亚细胞定位技术,初步研究这些基因在植物响应重金属Pb~(2+)胁迫过程中的功能。主要结论如下:(1)不同浓度Pb~(2+)处理本生烟草15天后,分析本生烟草的甲基化酶(CMT3、MET1、DRM2)和去甲基化酶ROS1的表达量、候选基因表达量的变化情况,可知Pb~(2+)胁迫能够诱导本生烟草中甲基化酶、去甲基化酶和7条候选基因表达水平改变。(2)不同浓度Pb~(2+)处理本生烟草引起候选基因所选区域DNA甲基化水平发生变化。(3)候选基因VIGS植物长势明显不如pYY13对照植物,有的甚至出现枯死。测定其中存活的基因对应植株叶绿素含量,发现NbHPT VIGS植物的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均降低;NbTM VIGS植物的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均增加,经800 mg·L~(-1) Pb~(2+)处理11天后,VIGS植物与对照植物比较,出现生长抑制,甚至枯死,分别取VIGS植物根、茎、叶,测定Pb~(2+)含量,发现与对照植物相比,NbHPT和NbWRKY VIGS植物根部Pb~(2+)含量明显减少,NbTM VIGS变化不明显;NbHPT VIGS植物茎内所含Pb~(2+)明显高于对照,NbWRKY VIGS则明显低于对照,NbTM VIGS变化不明显;对叶片Pb~(2+)含量测定结果可知,NbHPT、NbWRKY VIGS植物叶片中Pb~(2+)含量明显增加,而NbTM VIGS植物与对照相比差异不明显,说明候选基因沉默后其表达量下调,导致对应植物生长发育受到影响,叶绿素含量发生变化,对Pb~(2+)的耐受能力减弱,Pb~(2+)吸收紊乱。(4)亚细胞定位结果显示:NbDDRP定位在叶绿体、细胞质和细胞核中;NbEF、NbNADH定位于细胞核。NbVAPF没有观察到荧光信号,推测其可能定位于液泡,液泡中pH偏低,影响GFP发光。
【图文】：

技术路线图,技术路线,理论依据,路线

本实验技术路线图

变化情况图,变化情况,甲基化,甲基化酶

2.3 结果分析DNA 甲基化通过对基因组 DNA 的修饰，对生物遗传信息进行调节观遗传学方面入手。其重要作用表现在基因表达调控、发育调节、基因面。DNA 甲基化的特定状态是通过从头甲基化，，维持甲基化和活性去甲调节的结果，这个过程调节的酶是不同的。CMT3、MET1 和 DRM2 是的三种甲基化酶，ROS1 是去甲基化酶。重金属 Pb2+处理后会影响这几响其甲基化状态。0、400、800 mg·L-1Pb2+处理本生烟草后，将其 RN进行半定量 RT- PCR 和实时荧光定量 PCR 分析其表达量变化情况。2.3.1 甲基化酶 CMT3 表达量变化情况通过图 2.1 的结果可以看出：重金属 Pb2+处理后，NbCMT3表达量上调，mg·L-1上调程度高于 800 mg·L-1。
【学位授予单位】：内蒙古科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X173;Q943.2;S572

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