基于藤黄球菌Rpf的高效PCBs降解菌复苏培养及其降解特性研究

发布时间：2020-04-07 22:26

【摘要】：活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态因其分布广、易复苏的特性在微生物资源领域广受关注。多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)组成复杂,性质稳定是一种分布广泛的持久性有机污染物,生物降解PCBs技术是备受关注的研究热点,获得高效的PCBs降解菌则是研究的关键。然而通过普通培养方法获得细菌限制了筛选PCBs降解菌的能力,研究VBNC状态的功能菌将打开研究的新局面。本论文首先利用中心组合设计响应面分析法优化复苏VBNC状态菌的复苏促进因子(resuscitation promoting factor,Rpf)的制备条件;以Aroclor 1242作为碳源,利用富集驯化培养法联合16S rDNA高通量测序技术探究了Rpf对污染土壤中菌群活性以及结构产生的影响;利用最大或然数法(most probable number,MPN)法分离培养VBNC状态菌,另外,以3,3',4,4'-四氯联苯(3,3',4,4'-tetrachlorobiphenyl,PCB 77)为底物,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术研究bphA基因的表达;同时,以PCB 77为研究对象探究了高效PCBs降解菌的生长情况、降解动力学,通过气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)对中间代谢产物进行了探究。获得如下研究结果:(1)利用Design-Expert软件通过中心组合设计响应面分析法获得Rpf制备的最优条件为:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)的终浓度为33.9 mg/L、诱导细菌浓度即OD_(600)为0.4、诱导温度为20.3℃以及诱导时间为7.0 h。通过重复性实验对模型的可靠性进行验证,为Rpf作为生物修复助剂的推广和应用奠定物质基础。(2)在相同的Aroclor 1242浓度下,添加Rpf能有效的提高培养液中菌群的活性。当Aroclor 1242浓度的升高至100 mg/L时Rpf效果最显著,而随后Rpf效果降低,至200 mg/L时,Rpf复苏效果受限,处理组与对照组差别不明显。16S rDNA高通量测序技术分析结果表明Rpf能够有效改善功能菌群的多样性。Sphingomonas属、Pseudomonas属和Burkholderia属的细菌常作为PCBs转化剂,在添加Rpf后其相对丰度均有增加;从不同分类学水平上对菌群结构观察,Proteobacteria是对Rpf添加敏感最主要的门,该门中Alphaproteobacteria纲和Betaproteobacteria纲,以及属于Gammaproteobacteria纲的Pseudomonadaceae科中的大多数细菌具有PCBs降解效果。(3)成功分离复苏23株功能菌,其中Castellaniella sp.SPC4表现出优秀的PCB 77降解效果(50 mg/L PCB 77浓度下,降解率在两天的时间内超过40%)并检测出bphA基因的存在。bphA基因在Castellaniella sp.SPC4代谢PCB 77过程中表达数是一个上调的趋势,证实该过程有bphA基因的参与。(4)在不同PCB 77浓度下,Castellaniella sp.SPC4细菌生长情况和对PCB77的降解率表明该体系中只存在底物抑制并无产物抑制情况。Castellaniella sp.SPC4代谢PCB 77过程符合一级反应速率方程,同时构建PCB 77的微生物降解的动力学模型,该模型与Edward模型相匹配,拟合优度R~2为0.8055,最大比降解速率q_(max)为0.9315 1/h,底物亲和常数K_S为11.33 mg/L,底物抑制常数K_I为11.41 mg/L。另外,在Castellaniella sp.SPC4降解PCB 77过程中检测到氯代苯甲酸和有氯取代的2-羟基-6-氧代-6-苯基六-2,4-二烯酸(2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid,HOPDA)的存在,为PCB 77降解进行讨论。本研究探明藤黄球菌Rpf制备的优化条件为其有望成为生物修复助剂的推广和使用提供物质基础;考察了藤黄球菌Rpf促进PCBs降解菌群活性和改善菌群多样性的能力,为其作为一种生物修复助剂提供了理论基础。成功复苏分离VBNC状态的高效功能菌,将探索各种高效功能菌群的范围从常规可培养细菌扩宽到不可培养的领域。讨论了PCB 77降解过程中的降解动力学,为持久性有机污染物尤其是多氯联苯的生物修复技术的推广和应用提供理论支撑。
【图文】：

示意图,机制,细胞,生物脱硫

图 1.1 细胞 VBNC 状态的形成及复苏机制示意图Figure 1.1 Schematic diagram of mechanism of formation and resuscitation of VBNC cells图 1.2中37菌株归类于：Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes3个门；及 Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Actinobacteria和 Bacilli 5 个菌纲。其中，归属于 Gammaproteobacteria 的 Pseudomonas 属及Actinobacteria 菌纲的 Rhodococcus 属等在生物修复领域具有重要的意义。如Vaidya 等[87]报道了 Pseudomonas sp. ASDP1、Burkholderia sp. ASDP2 和Rhodococcus sp. ASDP3 这三株菌联合培养可降解高分子量的多环芳烃芘。关于Rhodococcus ruber 9C 的生物脱硫功能被 Mishra 等[88]报道。Carvajal 等[89]也报道了 Rhodococcus 属的细菌生物脱硫的应用。Su 等[86, 90]报道 Rhodococcus 及Pseudomonas 属的菌群生长可由 Rpf 促进。分析图 1.2，由 Rpf 复苏得到的细菌不仅包括高 G+C 革兰氏阳性菌更有低

外源菌,藤黄,球菌,自展

11球菌 Rpf 复苏分离所得菌株的系统发育树图示自展值（n=1000）均大于外源菌为：Esherichia coli Phylogenetic analysis of bacteria resuscitated by Rpf of Micrococcus luteus baNA gene sequences. Bootstrap values (n=1000) of above 50% are shown at theEsherichia coli was used as an outgroup内容、目的及意义究以 PCBs 污染土壤中的 VBNC 菌群为研究对象，，开展潜在功能菌及其降解特性的研究。主要研究内容包括以下 4 部分：藤黄球菌 Rpf 制备与优化中心组合设计思想设计实验，利用 Design-Expert 软件由二次多项得多元回归方程，通过有限次的实验对 Rpf 的产量进行分析优化
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X172;X592

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