秸秆降解菌株的筛选及酶活分析与关键基因功能鉴定

发布时间：2020-04-14 01:53

【摘要】：秸秆资源是世界上丰富的、可再生的生物质资源,其中富含碳、氮、磷、钾及矿物质元素,对改善土壤耕作性、增加有机质含量具有重要意义。但秸秆具有由纤维素、半纤维素、木质素等相互缠绕形成的致密结构,不易被降解利用。环保、有效的生物降解方法近年来备受关注,微生物分泌纤维素酶、半纤维素酶及木质素酶能有效降解秸秆中的主要成分,对提高秸秆的综合利用率发挥着重要的作用。本研究从盐碱土壤中分离筛选得到3株秸秆降解细菌,并对其秸秆降解发酵条件、秸秆降解能力、酶活特性及关键酶基因进行克隆及功能分析,具体研究结果如下:1.通过对6种土样中内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、木聚糖酶(xylanase)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)的酶活比较分析,从各酶活较高的盐碱土、松树土、杨树土中分离筛选出3株秸秆降解菌yj1,yj2,yj3,经革兰氏染色及16SrDNA鉴定分别确定为假单胞菌属(G㧟)、芽孢杆菌属(G㧏)、短杆菌属(G㧏)。3株菌降解秸秆的最适培养温度及最适初始pH值分别为37℃、8;30℃、8;37℃、7。培养8天时秸秆降解率分别为:25.58%、26.61%、23.71%,且发酵液pH一直保持在8左右。说明本实验获得的3种秸秆降解菌具有一定的耐碱性,对玉米秸秆具有较强的降解能力,其中秸秆降解菌yj2的降解能力最强。2.秸秆降解需要多种纤维素降解酶共同参与。以CMCNa为碳源时,yj2的EG、BG及xylanase酶活最高值分别为37.34U、266.89U、516.08U,而yj1、yj3无xylanase酶活,且EG、BG酶活仅为2.34U、2.23U。以秸秆为碳源时,yj2的EG、BG、xylanase、LiP、MnP、Lac的酶活相较于yj1、yj3均较高,6种酶共同作用降解秸秆,而yj1、yj3没有xylanase,主要依靠LiP、MnP、Lac降解秸秆。因此推断菌株yj2降解效果好主要由xylanase发挥作用。3.以CMCNa、秸秆为碳源的条件下,菌株yj2的EG、BG、xylanase三个基因表达量均表现为24h高于12h,EG、BG、xylanase基因表达量与酶活变化趋势一致。4.对3株菌的酶活分析可知,xylanase对秸秆降解具有重要作用,克隆得到该基因,命名为xylanase,大小为642bp,与NCBI提交木聚糖酶基因序列相似度均达95%以上。通过生物信息学分析表明,克隆得到的木聚糖酶属于糖基水解酶家族11(GH11),是一种带信号肽的、亲水的碱性胞外分泌蛋白。将xylanase基因与表达载体pET-30a连接,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,经SDS-PAGE蛋白电泳检测其融合蛋白大小为28 KDa。利用DNS法测定木聚糖酶酶活,BL21(pET-30a-xylanase)菌株xylanase酶活24 h内随时间的增加而增加,在24 h时酶活达到最大为387.26U,酶活的变化呈显著性差异。本研究还克隆得到内切葡聚糖酶基因,命名为EG,大小为1500bp。通过生物信息学分析可知属于糖基水解酶家族5(GH5),同时还含有碳水化合物结合域3(CBM3),同样为带信号肽的、亲水的碱性胞外分泌蛋白。
【图文】：

纤维素酶,纤维素

纤维素结构维素(cellulose)是由多个葡萄糖以 β-1,4-糖苷键连接组成的大分子多（C6H10O5）n，分子量约为 2.4×106，n 为聚合度，代表纤维素分子素的理化性质密切相关，不同类型的纤维素具有不同的聚合度：50上不等[12-13]。Lynd 等[14]研究表明，纤维二糖是纤维素的基本结构单基环含有 C2、C3、C6 位的碳原子上存在三个游离羟基位，与其他在分子间作用力及氢键作用下，使纤维素分子链形成原纤丝，原纤丝成更大的结晶性原纤维结构。玉米秸秆细胞壁中富含有纤维素，并与间共价连接，木质素和果胶等物质作为粘合剂更增强植物体的机械这种复杂且紧密的空间使玉米秸秆中的纤维素具有难溶性、难降解低了传统物理法、化学法处理对秸秆的降解效果。

纤维素水解,复合式,纤维小体

酶转化为葡萄糖[66]。通过蛋白质结构分析可知，木聚糖酶和纤维素酶均属于糖苷水解酶家族成员，并且均通过催化断裂 β-1,4-糖苷键实现的降解反应。催化反应主要由糖苷水解酶的两个氨基酸残基完成的，其中一个充当质子供体，另一个为亲核基团，机制可分为保留和反转两类[67]。1.4.2 复合式纤维素酶系统上述多种降解木质素的酶可能独立存在，也可能形成包含高效水解酶的一种蛋白质复合物或者有机体—纤维小体（cellulosome）[68]。Edward Bayer 等[69]于1983 年首次发现并提出此概念，随后在厌氧细菌和真菌中陆续发现纤维小体。纤维小体结构复杂，，体积庞大，包含一个无催化结构的绞手蛋白（CipA），CipA含有 9 个粘接蛋白，4 个 X-组件和 CBMIII，共需要 22 个催化结构域，最终通过II 型粘接蛋白结构域锚定在细胞壁上。由于纤维小体具有紧密的结构，使多种酶能协同作用加强水解作用，促进底物与产物有效传递，有利于宿主细胞高效地降解吸收纤维素[70-71]。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X172

【参考文献】