有机质污染水体及人工湿地对抗生素抗性基因接合转移效率的影响

发布时间：2020-05-09 02:24

【摘要】：四环素类抗生素是全世界近几十年来畜禽生产过程使用最广泛、频度最高、用量最大的一类;但影响此类抗生素抗性基因经接合转移扩散的自然因素少有报道,本研究以强力霉素抗性基因(Dox)为研究对象,(1)通过7个细菌性病原菌(其中6个为临床分离的病原菌,遗传背景不清楚;1个为条件性致病性产酸克雷伯氏菌的突变株TR-M30-1,为mTn5gusA-pgfp21转座子插入突变,Kan~R(卡那霉素抗性),本实验室保存)对18种常用抗生素的药敏实验获得此7个菌株的耐药谱,从耐药谱中筛选出抗生素抗性遗传型为Dox~RX~S的候选供体菌和抗生素抗性遗传型为Dox~SX~R的候选受体菌(X代表试验的18种抗生素中的任何一种);(2)供、受体菌共接合培养后筛选出抗生素抗性遗传型为Dox~RX~R的接合子,同时确定目标供、受体菌;(3)对目标供、受体菌进行形态学、生理生化、分子生物学和BIOLOG方法鉴定;(4)确定目标供、受体菌的四环素耐药基因及其可移动遗传元件;(5)检测养猪场排污渠不同地段和不同浓度的有机肥浸出液对目标供、受体菌的存活率及目标供体菌的Dox基因经接合转移至目标受体菌的效率;(6)构建狐尾藻(Myriophyllum spicatum L)、水葫芦(Eichharnia crassipes)、狐尾藻+水葫芦和无植物(空白对照)的下流式人工湿地,检测目标供、受体菌在人工湿地水体内的存活率及目标供体菌的Dox基因经接合转移至目标受体菌的效率;(7)分析了强力霉素抗性基因(Dox)在供、受体菌之间的接合转移效率与养猪场排污渠水体和人工湿地水体的pH值、化学需氧量(COD)、氨基酸种类和含量、总糖、还原糖、凯氏氮、总磷(TP)、有效磷的含量的相关性;(8)检测了人工湿地对COD去除效果;结果如下:(1)研究的7个病原菌耐药性均为多重性,最多能耐受15种抗生素,对链霉素(氨基糖苷类)、萘啶酮酸(喹诺酮类)、磺胺二甲嘧啶(磺胺类)抗生素的耐药率最高(100%),对庆大霉素(氨基糖苷类)、诺氟沙星(喹诺酮类)、环丙沙星(喹诺酮类)抗生素的耐药率最低(0)。目标供体菌抗生素抗性基因型选定为Dox~RKan~S,目标受体菌为Dox~SKan~R,接合子为Dox~RKan~R;接合子命名为Con-Ⅱ。(2)抗生素抗性基因型Dox~RKan~S的目标供体菌鉴定为Escherichia coli O157:H7(E.coli O157:H7);BIOLOG法鉴定目标受体菌TR-M30-1(Dox~SKan~R)的结果与于晓宇的16S rDNA分子鉴定的结果一致,均为产酸克雷伯氏菌。(3)E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)、TR-M30-1(Dox~SKan~R)、Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)的四环素抗性基因和可移动遗传元件检测结果为E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)和Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)携带tetB耐药基因,TR-M30-1(Dox~SKan~R)无。E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)含F质粒、I类整合子和I类整合子可变区;TR-M30-1(Dox~SKan~R)含F质粒和I类整合子可变区;Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)含F质粒和I类整合子。Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)的Dox~R并非由F质粒从E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)介导转移至TR-M30-1(Dox~SKan~R)的结果。(4)历时9 d,于第3、6、9 d测定,E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)和TR-M30-1(Dox~SKan~R)在完全培养基(LB)、养猪场排污渠不同地段水体、不同浓度的有机肥浸出液及人工湿地系统水体中其存活率较原始浓度(0 d)均逐渐下降且处理组的下降速率较对照(LB培养基)者大;在LB培养基内,两者第3 d存活率无差异(从平均值±标准差判断,下同),但第6、9 d时,TR-M30-1(Dox~SKan~R)存活率大于E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);有机质污染水体(养猪场污水和有机肥浸出液)中两者的存活率高于人工湿地水体。在时间维度上(0-3 d,3-6 d,6-9 d),存活率呈现特征:(1)减-减-增者为:养猪场排污渠3个地段(上、中、下游)污水、150 g有机肥+1 L蒸馏水中的E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);养猪场排污渠(上、下)游、(150、100、50)g有机肥+1 L蒸馏水、狐尾藻人工湿地环境中的TR-M30-1(Dox~SKan~R);(2)减-增-减者为:最大持水量状态有机肥(含水量57%)、(100、50)g有机肥+1 L蒸馏水、无植物人工湿地水体中的E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);200 g有机肥+1 L蒸馏水中的TR-M30-1(Dox~SKan~R);(3)减-减-减者为:(1)和(2)以外的其他试验条件,如:(200、10)g有机肥+1 L蒸馏水、(水葫芦、狐尾藻、水葫芦+狐尾藻)人工湿地、LB培养基中的E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);养猪场排污渠(中游)、最大持水量状态有机肥(含水量57%)、10 g有机肥+1 L蒸馏水、(水葫芦、水葫芦+狐尾藻、无植物)人工湿地、LB培养基中的TR-M30-1(Dox~SKan~R)。(5)完全培养基(LB)、养猪场排污渠不同地段、不同浓度的有机肥浸出液及人工湿地系统中E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)、TR-M30-1(Dox~SKan~R)共培养3 d时的接合效率高低顺序为:LB培养基(3.25×10~(-6))养猪场排污渠上游(1.124×10~(-6))养猪场排污渠中游(9.03×10~(-7))最大持水量状态有机肥(含水量57%)(6.23×10~(-9))人工湿地系统(0)。(6)E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)、TR-M30-1(Dox~SKan~R)共培养3 d时的接合效率和水质相关因素的Pearson相关性分析显示:pH值与接合效率呈显著负相关性(p0.05);化学需氧量(COD)与接合效率呈显著正相关性(p0.05);氨基酸含量与接合效率呈极显著正相关性(p0.01);接合效率与总糖、还原糖、凯氏氮、总磷(TP)、有效磷等无显著相关性。(7)狐尾藻、水葫芦、狐尾藻+水葫芦和无植物空白对照组人工湿地对COD_(cr)平均去除率分别为:38.82%、34.1%、32.37%和40.75%。
【图文】：

大肠埃希菌1（DoxRKanS）药敏筛选结果图

TR-M30-1（DoxSKanR）药敏筛选结果图
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X52

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