海洋微藻胞外腹泻性毒素轮廓分析及光降解动力学研究

发布时间：2020-05-11 16:04

【摘要】：近年来,随着全球气候变化和近海环境污染的不断加剧,海洋有害藻华释放的生物毒素对海洋生态系统、海产养殖业及人类健康造成严重威胁。腹泻性毒素(DSP)是海洋产毒甲藻产生的一类次生代谢产物,可在贝类体内富集和转化,人类食用被DSP污染的贝类后会引起中毒反应。迄今为止,国内外有关腹泻性毒素的研究主要集中于海产品中DSP的检测、食用安全风险评估,产毒藻细胞内DSP的发现、表征,环境因子对产毒藻积累DSP的影响等;对释放到产毒藻胞外环境中DSP的表征及其在自然环境中的降解规律研究鲜有报道。本研究开发了一种适用于全面筛查、表征和定量测定产毒藻胞外DSP轮廓分析的有效方法且应用于实际样品分析检测,并以大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素1(DTX1)2种典型DSP为模型化合物,系统研究自然条件下OA和DTX1的降解规律以及各环境因素对光降解的影响。具体内容如下:1.本研究发展了一种基于固相萃取和高效液相色谱-高分辨质谱/多级质谱联用分析的海洋有害藻胞外DSP轮廓分析新方法,并将该方法应用于利玛原甲藻(Prorocentrum lima)培养液中胞外DSP及其衍生物的鉴别和定量测定。结果表明,固相萃取法和大孔吸附树脂法对利玛原甲藻培养液中的DSP均具有较好的富集作用,方法回收率为94.8-100.58%、重复性考察相对标准偏差(RSD)均≤9.27%。以已知DSP及其衍生物精确质量数为先验信息,辅以商品化软件数据分析,从利玛原甲藻培养液中成功鉴定了9种DSP,其中7种毒素(包括OA-D7b,OA-D9b,OA-D10a/b等)均是首次从培养液中发现。定量测定结果显示,利玛原甲藻培养液中胞外DSP含量较高,不同生长时期利玛原甲藻胞内外毒素的种类和含量均有明显变化,在培养液中OA和DTX1的浓度分别在19.9-34.0μg/L和15.2-27.9μg/L之间,DSP物质群的总浓度在57.70-79.63μg/L范围内,表明胞外毒素浓度不可忽视。说明该方法是海洋有害藻培养液中胞外DSP轮廓分析的有效方法,为获得产毒藻胞内与胞外毒素种类和含量的综合信息,开展胞外毒素的毒性机理、环境化学行为等研究提供技术支撑。2.通过室内和室外的模拟降解实验,对2种典型DSP在海水中的光降解动力学和降解产物进行了初步研究。首先,探究了在室外太阳光自然照射下OA和DTX1在不同月份、不同浓度条件下的降解规律。在黑暗对照中OA和DTX1未发生明显损失,表明这主要是光介导的反应过程。海水中高浓度OA和DTX1的去除率高于低浓度组,30天内去除率大于90%,且自然光降解过程中OA和DTX1含量波动明显,表明OA与DTX1的光降解是同时涉及可逆和不可逆反应的复杂过程。其次,以汞灯为光源,通过室内模拟实验,系统地考察了海水pH值、金属离子强度、溶解氧及有机质含量等因素对OA和DTX1光降解的影响。在汞灯辐照下,OA和DTX1的降解符合一级反应动力学模型。腐殖酸含量与pH值越高,OA和DTX1光降解速率越慢,且pH值的影响尤为显著;金属离子与溶解氧对OA和DTX1的光降解具有明显促进作用。此外,利用高效液相色谱-高分辨质谱联用技术,对OA和DTX1的转化产物进行了初步鉴别,OA与DTX1在光照条件下各产生3种主要的降解产物,其分子式分别为C_(25)H_(38)O_9、C_(44)H_(70)O_(14)、C_(43)H_(66)O_(11)和C_(25)H_(38)O_9、C_(45)H_(72)O_(14)、C_(44)H_(68)O_(11)。降解产物结构的进一步鉴定以及毒性分析等研究还需进一步探究。综上所述,本文建立了基于高效液相色谱-高分辨质谱/多级质谱联用分析的DSP产毒藻胞外毒素代谢物轮廓分析的新方法,实现了对利玛原甲藻培养液中胞外DSP的筛查与鉴别,并初步阐明了不同生长阶段利玛原甲藻胞外DSP的释放特征。以OA和DTX1为研究对象,初步阐明了自然光照条件下海水中OA和DTX1的去除周期,以及不同环境因子对OA和DTX1的光降解动力学的影响,并对其光转化产物进行了初步鉴定。本文研究结果可为海洋产毒藻胞外DSP代谢物的轮廓分析提供技术支撑,还可为阐明DSP在自然环境中的归趋以及环境风险提供科学依据,对客观评估有害藻释放DSP造成的生态风险具有重要意义。
【图文】：

固相萃取法,直接取样法,总离子流,培养液

29图 2-1 P. lima 培养液样品经 3 种方法处理后的 HPLC-ESI/MS 分析总离子流 TIC 图（a :直接取样法；b :固相萃取法；c :大孔吸附树脂法）Fig. 2-1 TIC of the P. lima culture medium after three methods analyzed by HPLC-ESI/MS (a:direct sampling; b: solid phase extraction; c: macroporous adsorption resin)但是，与直接取样法（图 2-1a）相比，经固相萃取法(图 2-1b)和大孔吸附树脂法(图 2-1c)处理的样品 TIC 图中 OA 和 DTX1 的峰强度明显提高，信噪比增加显著，说明采用固相萃取法和大孔吸附树脂法进行样品处理，可显著提高产毒藻培养液中 DSP 检测灵敏度。图 2-2 是 m/z 827 离子(OA，[M+Na]+离子峰)EIC 图，，可以看出经固相萃取法和大孔吸附树脂法处理后样品的 EIC 图（图 2-2b 和 c）中有明显的 OA 同分异构体峰，而图 2-2a 中的同分异构体峰并不明显，这进一步说明样品经富集方法处理后可以提高样品中低含量 DSP 的发现效率，就两种

离子流,培养液,固相萃取法,样品

图2-2 P. lima培养液样品经3种方法处理后的HPLC-ESI/MS分析OA 提取离子流（EIC）图（a: 直接取样法；b: 固相萃取法；c: 大孔吸附树脂法）Fig. 2-2 EIC of OA in P. lima culture medium after three methods analyzed byHPLC-ESI/MS (a: direct sampling; b: solid phase extraction; c: macroporous adsorption resin)本实验以回收率和重复性为评价指标，对固相萃取法和大孔吸附树脂法用于P. lima 培养液中 OA 和 DTX1 的定量适用性进行了考察；采用标准加入法进行方法回收率的测定。平行取 6 份 f/2 培养液均加入一定量的 OA 和 DTX1 标准溶液，3 份按 2.7 节的固相萃取法处理，另外 3 份按 2.7 节的大孔吸附树脂被动吸附法处理，然后采用2.4节色谱质谱条件测定加标回收率和重复性，测定结果见图2-3，可以看出，固相萃取法对 OA 和 DTX1 的回收率为 103.65%和 94.8%，RSD（n=3）值均小于 5.4%；大孔吸附树脂法对 OA 和 DTX1 的回收率分别为 110.3%和100.58%，RSD（n=3）值均小于 9.27%。表明这两种方法均具有较好的回收率和重复性, 能满足实际藻培养液样品中 DSP 定量测定的要求。综上所述，就产毒藻培养液中 DSP 的筛查鉴别而言，直接取样法能满足培
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X55

【参考文献】