基于PCR-FRET的大肠杆菌快速检测新方法的建立

发布时间：2020-06-07 23:27

【摘要】：在自然环境中,饮用水水源很容易受到病原微生物的侵染,被污染的水体中,通常能检测出大量的致病菌和肠道病毒。大肠杆菌作为水源中病原菌的标准指示菌,对水质安全监测具有重要意义,我国国标GB5749-2006生活饮用水卫生标准中严格规定：饮用水的大肠杆菌限值为每1 OOmL不得检出。然而,目前大肠杆菌的标准检测方法仍以传统检测方法为主,这些检测方法耗时长、操作繁琐,不适合对水样进行实时监控。如何快速准确检测出水体中大肠杆菌称为人们研究的热点。本论文围绕大肠杆菌快速检测来展开研究工作,选取高特异性、高灵敏度的PCR和具有准确定量的FRET原理来实现对大肠杆菌的检测。首先建立普通PCR法。选取大肠杆菌的特异性保守性基因uidA作为目标检测物,对uidA进行引物设计后进行PCR实验,在保证引物的特异性和准确性后克隆成质粒,并根据质粒对PCR扩增的反应体系和反应条件进行筛选和调控,最后得到最佳的PCR扩增条件。然后建立QDs-Cy5基的FRET检测体系。选取反应条件温和的水相回流法来合成CdTe量子点,通过调节回流时间得到一系列发光效率较好的量子点。选取量子产率为53%、发射在602 nm的CdTe量子点为FRET的供体,根据Forster原理对比量子点与染料的吸收和发射光谱,选取在600 nm左右有较强吸收的花菁染料Cy5作为FRET的受体。根据目的DNA设计的一组适配子,与供受体对连接后形成捕获探针和报告探针,两组探针可与目的DNA特异性结合形成夹心结构并通过FRET来实现对目的DNA的检测。对检测中可能影响的因素进行适当调控后,成功对uidA基因进行了检测,其检测限为2nmol/L,且在2nmol/L-100 nmol/L范围内有良好的线性关系,线性系数为0.999。最后联立PCR-FRET,其可在3h内完成对大肠杆菌的检测。对uidA基因的检测结果显示其可检测到30copies的uidA,比普通PCR法的检测限约低一个数量级；该方法可检测大肠杆菌浓度在103-107 CFU/mL范围内的水样,最后对实际水样进行了检测,检测结果与平板法和普通PCR法结果相一致,但准确度还有待进一步提高。
【图文】：

快速扩增,大肠,准确度,手段

是Ｍｉｌｌｕｓ和Ｃｅｔｕｓ于１９８３年在Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志上发表的一种体外ＤＮＡ快速扩增技术，其逡逑模拟生物体内ＤＮＡ复制过程，Ｗ目的ＤＮＡ为模板，在ＤＮＡ聚合酶的作用下，使ＤＮＡ逡逑数量呈指数形式增加。其原理分为Ｈ个步骤（如图１．１所示）。逡逑第一步高温变性，，在９０－９６°Ｃ较高温度下，双链ＤＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ邋ＤＮＡ，ｄｓＤＮＡ）逡逑中的氨键断裂，解旋为两条单链ＤＮＡ邋（Ｓ虹ｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ，ｓｓＤＮＡ）；逡逑第二步低温退火，在４５－６５°Ｃ较低温度下，引物根据碱基互补配对原则，与两条模逡逑板ＤＮＡ结合形成局部杂交链；逡逑第Ｈ步中温延伸，在７０－７５‘Ｃ时，耐热ＤＮＡ聚合酶４种核巧酸（腺V蚜牒饲伤徨义希洌粒裕小⑿叵俾郧珊饲伤幔洌裕裕小⒛窈僖骱饲伤幔洌牵裕小孪宋羲幔洌茫裕校┪瓘/，从逡逑引物的３’端开始，｛＾目的０？八单链为模板，从５’－３’的方向合成互补链。逡逑经过这三个步骤（一个热循环）后，一个ｄｓＤＮＡ分子扩增为２个具有同样碱基序逡逑列的ｄｓＤＮＡ分子。随着Ｈ个步骤的循环往复

示意图,示意图,染料,光强度

量转移给染料，使得ＤＮＡ－染料复合物发射的英光强度比游离的染料发射的巧光强度大逡逑得多。常用的核酸染料巧澳化乙锭化出ｉｄｉｕｍ邋Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）、ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ和ＧｅｌＲｅｄ逡逑等，巧中，ＥＢ与ＤＮＡ的结合如图１．２所示。Ｑｉｎｇ邋ｔｉｕａｎｇ等人Ｐ７哺Ｍ．Ｃ．Ｍ．邋Ｃｏｕｔｏ等人逡逑ｐｓｊ比较了邋ＥＢ、ＳＹＢ民Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ和ＧｅｌＲｅｄ三种核酸染料对ＰＣ民凝胶电泳结果的影响，结逡逑果显示：灵敏度说化６（１＞５￥８１１６化６１１１＞￡８，且0６１民６（］不仅灵敏度较其他二者高，而逡逑且稳定性好、对化物体毒性较小。逡逑－８邋－逡逑
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TU991.21;X832

【共引文献】