转TaGSTF3拟南芥对重金属铅和镍胁迫响应的初步研究

发布时间：2020-09-24 13:51

　　随着现代工业发展和世界人口的不断增长,矿石及其它来源的重金属逐渐流入周边环境,不断对土壤、水体及空气造成严重污染。重金属污染直接影响了植物尤其是作物的生长,造成农作物减产。然而,人们对植物响应重金属胁迫机制的关注远远不够。为确保合理利用植物进行重金属污染治理,亟待更多抗重金属相关机制的深入研究。实验室前期以普通小麦济南177(JN177)和长穗偃麦草为亲本,通过非对称体细胞杂交的技术,选育出耐盐碱小麦渐渗系新品种—山融4号(SR4)。利用第二代高通量测序技术从SR4耐盐碱转录组中克隆了一个受诱导上调表达的小麦谷胱甘肽转移酶基因TaGSTF3,其开放阅读框全长约669 bp。将该基因构建入双子叶植物表达载体pRI101-AN。以农杆菌介导的花器官浸染法转化拟南芥Col-0,获得了两个转TaGSTF3拟南芥过表达株系。研究发现异源过表达TaGSTF3基因的拟南芥并未表现出抗盐碱旱等逆境胁迫的功能。但经重金属硝酸铅Pb(N03)2和硫酸镍NiSO4处理后,TaGSTF3过表达拟南芥表现出对Pb2+和Ni2+的胁迫抗性。据此,本论文通过对过表达TaGSTF3拟南芥表型、功能等的初步探究,发现了TaGSTF3响应Pb2+和Ni2+的可能机制。1、过表达TaGSTF3拟南芥的铅耐受性分析在培养皿生长条件下,铅Pb2+胁迫处理后,过表达系相较野生型地上部更大,根系更长更发达;生长在土壤中的过表达系,经铅Pb2+胁迫处理后,表现出比野生型更明显的生长迟缓,植株矮小,所结荚果少的表型。通过对培养皿中生长的WT、OE1和OE2植株鲜重统计,叶绿素含量、丙二醛含量、总谷胱甘肽含量及ROS清除酶活力测定,结果显示,与野生型相比两个过表达系经铅(Pb2+)胁迫处理后,其鲜重、总叶绿素含量、总谷胱甘肽含量、POD酶活力更高;丙二醛含量及SOD酶活力则显著低于野生型,表现出更高的耐铅Pb2+胁迫能力。DAB和NBT染色结果显示转TaGSTF3过表达系积累的ROS更少。ROS相关Marker genes表达分析显示,经铅Pb2+胁迫处理后过表达系ROS合成相关Marker genes表达量显著低于野生型,ROS清除相关Marker genes表达量显著高于野生型。铅胁迫相关基因AtATM3、AtPDR12和AtGSH1的表达分析结果显示TaGSTF3可能通过AtATM3和AtGSH1调控对铅Pb2+的耐受性。利用GSH合成抑制剂BSO(丁硫氨酸-亚砜亚胺)对过表达系的抑制结果表明,转TaGSTF3拟南芥对铅Pb2+的耐受性依赖于GSH。综上,转TaGSTF3拟南芥响应铅Pb2+的机制可能与依赖GSH的代谢途径及ROS信号通路有关。2、过表达TaGSTF3拟南芥的镍耐受性分析培养皿生长条件下,镍Ni2+胁迫处理后,过表达系相较野生型地上部更大,根系更长更发达;土壤生长条件下,镍Ni2+胁迫处理后,过表达系和野生型均表现出地上部青枯,叶片褪绿、黄化,但是过表达系较野生型叶片更绿。通过对培养皿生长条件下的WT、OE1和OE2植株鲜重统计,叶绿素、丙二醛和总谷胱甘肽含量测定及ROS合成和清除酶活力测定,结果显示经镍Ni2+胁迫处理,两个过表达系植株鲜重更高,总叶绿素、丙二醛、SOD酶活力、POD酶活力及总谷胱甘肽含量显著高于野生型,表现出对镍Ni2+胁迫更高的耐受能力。DAB和NBT染色结果显示转TaGSTF3过表达系积累的ROS更少。ROS相关Marker genes表达分析显示过表达系植株在镍Ni2+胁迫处理后ROS合成相关Marker genes表达量显著低于野生型,ROS清除相关Marker genes表达量显著高于野生型。以GSH合成抑制剂BSO处理结果表明,转TaGSTF3拟南芥对镍Ni2+的耐受性依赖于GSH。综上,转TaGSTF3拟南芥耐镍Ni2+的响应机制可能与依赖GSH的代谢途径有关。ROS信号通路亦可能在TaGSTF3介导的耐受重金属镍机制中发挥重要作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X503.23;Q945.78
【部分图文】：

解毒作用,金属的,复合物,液泡

（ＸｉａｎｇｅｔａＬ，２００１），推测可能是因为仅凭ＧＳＨ并不足以支撑植物耐受重金逡逑属的复杂机制（ＮｏｃｔｏｒｅｔａＬ，邋１９９８）。Ｙａｄａｖ等（２０１０）总结了植物耐受重金属逡逑胁迫可能的三个路径（如图１．５）邋：邋１、通过螯合重金属离子将其从质膜栗出，逡逑将重金属与细胞质中各种含巯基的化合物连接然后转运隔离到液泡中。２、其他逡逑抗氧化和修复机制可能也参与耐受过程。Ｐｉｅｃｈａｌａｋ等（２００２）研宄发现，ＰＣｓ会逡逑响应铅胁迫而合成并形成ＰＣ－Ｐｂ复合物，但是这个复合物向液泡的转运并不清逡逑楚。在拟南芥中的研宄发现ＰＣｓ要在根系和地上部分之间经过长距离的运输，逡逑Ｍｅｎｄｏｚａ－Ｃｏｚａｔｌ等（２００８）的研宄表明ＰＣｓ和ＧＳＨ可作为Ｃｄ长距离运输的逡逑载体（形成ＰＣ－Ｃｄ或ＧＳＨ－Ｃｄ复合物）。然而，关于ＧＳＨ－Ｍ复合物的跨膜逡逑运输目前知之甚少。己知一种拟南芥线粒体蛋白、ＡＴＰ结合转运蛋白ＡｔＡＩＭ３，逡逑１０逡逑

蛋白结构

TaGSTF3蛋白结构分析

氨基酸序列,膜结构,拟南芥,氨基酸序列

通过ＮＣＢＩＢｌａｓｔｐ程序比对ＴａＧＳＴＦ３与其他几种植物的氨基酸序列，结果逡逑，ＴａＧＳＴＦ３邋与玉米邋ＧＳＴ８邋（ＡＡＧ３４８１６．１）、大麦邋ＧＳＴ邋（ＣＡＤ１１９６６．１）、逡逑邋ＧＳＴ２１邋（ＮＰ＿００１２９１４４６．１）和拟南芥邋ＧＳＴ邋（ＮＰ＿１９１８３５．１）氨基酸序列一逡逑分别为６４％、５８％、５１％和５０％。利用Ｃｌｕｓｔａｌｘ软件多序列比对分析可逡逑不同物种中ＧＳＴ蛋白序列相对比较保守（图３．４Ａ）。利用ＭＥＧＡ５．１软逡逑小麦谷觥甘肽转移酶ＴａＧＳＴＦ３进行了系统发育分析（图３．４邋Ｂ）。分析显逡逑在进化过程中ＴａＧＳＴＦ３蛋白与短柄草而ｔｏｃ／７＞ｗｗ）的亲缘逡逑较近，而与拟南芥（也0６／￡／0；？７＿５／／７0／／（皿７）较远。逡逑

【参考文献】