辽河口沉积物中16S rRNA和amoA基因的丰度和多样性研究

发布时间：2020-09-28 06:25

　　近年来,全球人为来源活性氮的过量排放破坏了河口及海洋近岸生态系统,造成了部分生态功能丧失、生物多样性减少、水体富营养化、有害赤潮频发等现象。氮是生物地球化学循环中的重要生源要素,是限制河口生态系统生物生产力的元素之一,河口中氮的生物地球化学循环对河口生态系统生产力可持续性乃至全球环境变化都有影响。硝化作用作为连接固氮和反硝化作用的中心环节,可以缓解河口环境中氨态氮的毒性,是全球氮循环的重要过程。氨氧化是硝化作用的第一步和限速步骤,将氨盐(NH_4~+)氧化为亚硝酸根(NO_2~-),参与此过程的微生物主要是氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB),是富氮环境中重要的生物修复过程,具有重要的生态学意义。于2016年7月在辽河口采集实验样品,运用分子生物学的方法研究辽河口古菌、细菌和氨氧化微生物的丰度和群落结构。主要研究内容及其结果如下:1、采用Illumina Miseq测序技术进行古菌和细菌16S rRNA基因序列分析。结果表明:辽河口表层沉积物中细菌多样性高于古菌多样性,近岸细菌和古菌多样性高于远岸。主要古菌群落为奇古菌门(Thaumarchaeota,72.73%)和广古菌门(Euryarchaeota,25.05%);细菌群落组成中变形菌门(Proteobacteria,61.94%)为该河口的优势菌群,其次为拟杆菌门(Bacteroidetes,11.21%)和酸杆菌门(Acidobacteria,5.59%)。2、采用实时荧光定量PCR技术确定古菌、细菌16S rRNA和氨单加氧酶(amoA)基因的丰度。结果表明:古菌16S rRNA基因丰度变化范围为1.05×10~8~1.31×10~9 copies/g;细菌16S rRNA基因丰度在3.05×10~(10)~1.37×10~(12)copies/g之间变化,比古菌丰度高出2~3个数量级。AOA amoA基因丰度变化范围为3.10×10~6~2.85×10~7 copies/g;AOB amoA基因丰度在6.59×10~5~1.20×10~7 copies/g之间变化,所有站位AOA丰度均高于AOB。3、采用构建amoA基因克隆文库的方法分别研究氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的群落结构及其受到环境因素的影响。系统发育结果表明:AOA amoA基因序列分别聚为不同的4簇(ClusterⅠ~Ⅳ),主要类群为Nitrosopumilus和Nitrosophaera,Nitrosopumilus为最大的类群;除了1号和5号站位外,其余所有站位的序列均被检测到在这一簇。AOB amoA基因序列分别聚为不同的2簇(Cluster A和Cluster B),第一簇为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas),包含9条序列;第二簇的分类地位未知,主要来源于河口沉积物和湿地土壤。4、群落结构与环境因子的典范对应分析(CCA)表明:影响表层沉积物中AOA群落分布的主要水环境因子为盐度(Salinity)、酸碱度(pH)、氨盐(NH_4~+)和电导率(Cond),但是并没有发现水环境因子对辽河口沉积物AOB群落的显著影响。沉积物环境因子中对AOA群落结构影响显著的有砂质含量(Sand)、泥含量(Silt)和总磷(TP),对AOB群落结构影响显著的有砂质含量(Sand)和泥含量(Silt)。由此可见,不同环境条件下微生物的群落结构存在空间异质性,不同微生物对同一环境条件的响应亦不同。本研究以辽河口近岸表层沉积物为研究对象,从微生物分子生态学的角度研究氨氧化过程,以揭示辽河口沉积物中的古菌、细菌和氨氧化微生物的丰度和群落结构特征,研究结果将有助于加深河口区域微生物参与生物地球化学循环的认识。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X52
【部分图文】：

位图,分光光度法,操作步骤

图 2-1 采样站位图Fig.2-1 Distribution of sampling stations对每个站位的水样和沉积物样进行环境参数的测定。其中，底层水的温度（Temp）、（Salinity）、pH、电导率（Cond）通过美国 YSI 556MPS 便携式多参数水质测量仪测定；溶氧（DO）采用碘量法测定，氨氮（(NH4+）、亚硝酸盐(NO2-）、硝酸盐(NO3-）酸盐（PO43-）分别采用次溴酸盐氧化法、萘乙二胺分光光度法、锌-镉还原法和磷钼光光度法测定；具体的操作步骤参照 GB17378.4-2007。沉积物的总有机碳（TOC）、（TP）和总氮（TN）分别用重铬酸钾氧化-还原容量法、分光光度法和凯式滴定法；粒度（Grain size）采用激光粒度分析仪进行测定；具体的操作步骤参照7378.5-2007。.2 基因组 DNA 提取使用 DNA PowerSoil Total DNA Isolation Kit 提取试剂盒（MO BIO，USA）从 0.25沉积物样品中提取基因组 DNA（具体操作过程参照说明书进行），采用 1.5%（w/v）

电泳条,古菌

图 2-2 DNA 电泳条带Figure 2-2 Electrophoresis results of DNA.2.3 16S rRNA 基因的 PCR 扩增结果由通用引物进行 PCR 扩增后，结果如图 2-3，所有站位均含古菌和细菌 16S rRNA因片段，且目的条带单一，空白对照无污染。图 2-3 16S rRNA 基因的 PCR 扩增条带

条带,PCR扩增,古菌,通用引物

图 2-2 DNA 电泳条带Figure 2-2 Electrophoresis results of DNA2.3 16S rRNA 基因的 PCR 扩增结果由通用引物进行 PCR 扩增后，结果如图 2-3，所有站位均含古菌和细菌 16S rR因片段，且目的条带单一，空白对照无污染。

【参考文献】