北方寒地苯酚降解菌的筛选及鉴定

发布时间：2020-11-15 13:00

　　 本试验旨在获得典型苯酚污染环境中苯酚降解菌,筛选北方寒地苯酚高效降解菌并对其进行鉴定,优化所筛选苯酚降解菌株的培养环境因素条件,为东北地区含酚污水生物处理提供理论基础和数据资料。将在化工厂、发电厂和生活废水污染区采取的土样、水样和底泥做为菌种来源;应用含酚培养基对采自于典型苯酚污染环境的微生物进行分离培养;对所得耐酚菌株依次在苯酚浓度为500 mg·L~(-1)、700 mg·L~(-1)、900 mg·L~(-1)、1100 mg·L~(-1)的环境下进行反复驯化,从而筛选出北方寒地苯酚高效降解菌株;应用16S rRNA基因测序,所得基因序列通过Blast进行同源序列搜索,确定其系统发育地位,构建系统发育树。结合细菌形态、接触酶试验、氧化酶试验、葡萄糖氧化发酵试验、乳糖发酵试验、淀粉水解试验、甲基红试验、靛基质试验、H_2S试验、枸橼酸盐利用试验等生理生化试验,进行筛选菌株的菌种鉴定;根据接菌量、初始苯酚添加量、摇瓶装量、温度等因素的单因素试验结果,应用Design-Expert 10.0.7软件进行响应面法Box-Behnken实验设计,对高效苯酚降解菌的培养环境因素进行优化,以得到最佳培养环境条件。从采自于典型苯酚污染环境的试样中,得到苯酚耐受菌株10株,其中具有苯酚降解能力的菌株5株,降酚能力较好的菌株1株。该菌株为革兰氏阳性芽孢小杆菌,对庆大霉素和红霉素敏感。经16srRNA测序,对比基因序列数据库鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。通过对接菌量、摇瓶装量、苯酚添加量及温度等影响苯酚降解菌株培养环境因素的探索,利用响应面法对苯酚降解菌株培养环境因素进行优化,得到四种因素对苯酚降解率的回归方程,并计算出理论最佳降解培养环境因素条件为:接种量为7.63%(V/V),底物浓度为685.4 mg·L~(-1),摇瓶装量为59.43 mL,温度为27.54℃,理论苯酚最佳降解率为23.42%,与验证试验结果相符。经过筛选与驯化,从采自北方寒地典型苯酚污染场所的试样中得到苯酚降解能力较高的菌株。先进行富集培养与菌种分离,再进行反复驯化的方法可以筛选苯酚降解能力较高的菌株。与已报道比较,该菌株更适用于北方寒地较低的温度条件。
【学位单位】：佳木斯大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172;X703
【部分图文】：

吸光度 0.023 0.031 0.045 0.096 0.145 0.191 0.278 0.331苯酚浓度mg/mL 0.0000 0.0001 0.0002 0.0006 0.0010 0.0014 0.0020 0.0025图6-1 苯酚浓度标准曲线Figure 6-1 The standard curve of phenol concentration6.2 菌种的初筛从3 个采样地点共筛选出 10 株在含酚 500mg·L-1牛肉膏蛋白胨平板上生长良好的耐酚菌，其中化工厂处5 株分别标记为 H1、H2、H3、H4 和H5，发电厂处 2 株分别标记为D1、D2，音达木河处 3 株分别标记为Y1、Y2 和Y3。6.3 苯酚降解菌的驯化与复筛初筛后的10 株耐酚菌在苯酚为唯一碳源的无机盐驯化培养基多次传代驯化，进一步筛选出5 株具有降解能力的菌株，编号为 H2、H3、H5、D1 和Y3。其中化工厂三株，发电厂和音达木河各一株。在容积为 200mL 的锥形瓶中，加入 50.00 mL苯酚含量为500 mg·L-1无机盐驯化培养基中

图6-2 H5 菌株系统发育树Figure 6-2 Phylogenetic tree of H5 strain 高效降酚菌降酚条件的优化.1 单因素实验结果分别对接菌量、摇瓶装量、苯酚初始浓度及温度等四个培养环境因素进行单因素，为响应面法优化苯酚降解菌培养环境因素提供基础数据。.1.1 接菌量对 H5 降酚率的影响检测不同接菌量对 H5 菌株苯酚降解率的影响，通过接菌量不同，其他条件相同用紫外可见光分光光度法，测量培养液中残余苯酚含量。计算降解率，检测苯酚降与不同接菌量之间的线性关系，结果如图6-3。由降解率曲线变化规律可知随着接种的增大，降解率先增加，后下降，这可能是由于菌体初始浓度过大，培养基的营养消耗过快，细菌代谢的有害物质迅速在培养基中积累，不利于细菌的正常生长，因不是菌株接种量越大越好。

当摇瓶装量超过90.00 mL后降解率变化不大，见图 6-4。之所以产生这样的现象，应与在不同装量条件下系统内溶氧量有关。图6-4 摇瓶装量对苯酚降解的影响Figure 6-4 The shake bottle loading quantity on phenol degradation6.5.1.3 苯酚初始浓度对不同浓度的苯酚降解情况如图 6-5 所示，当苯酚初始浓度逐步增加，苯酚降解率也随之上升，苯酚初始浓度在 500 mg·L-1~700 mg·L-1之间H5 菌株的降解率维持较高水平，之后迅速下降。当苯酚初始浓度超过 900mg·L-1后曲线平伸。
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本文编号：2884787