基于异源MVA途径的大肠杆菌高效合成番茄红素代谢途径工程

发布时间：2020-09-15 21:24

　　番茄红素是一种深红色类胡萝卜素,属于C40萜类化合物。作为人体必需的营养物质,番茄红素具有抗氧化性、提高免疫力、预防眼部及心血管疾病等功效,是时下畅销的保健品之一。利用基因工程大肠杆菌生产番茄红素具有产量高,易于放大等优点,因此受到广泛关注。通过向大肠杆菌宿主细胞内导入异源甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径增加前体供给可以免于内源调节机制控制,是构建高产番茄红素工程菌株的常用手段之一。但是,由于涉及多个操纵子和基因的协同作用,常用的质粒表达系统存在不稳定性,并引起工程菌株的延迟期过长。为了克服这些不足,构建整合型工程菌株是有效途径之一。为此,本论文共构建了 3种代谢途径拷贝数模型:1)拷贝数不可控的双质粒表达系统模型;2)不完全可控的代谢途径拷贝数模型(MVA途径拷贝数可控);3)可控的代谢途径拷贝数模型。利用第3种模型,结合基因组多位点整合策略,成功构建出一株基于异源MVA途径的整合型高产番茄红素大肠杆菌工程菌株。主要内容如下:一、构建基于双质粒系统装载MVA下游途径和番茄红素合成途径的工程菌株。以整合了 MVA上游途径操纵子的高产甲羟戊酸工程菌株DHGT7E为宿主,结合装载人工合成的MVA下游途径操纵子和番茄红素合成途径操纵子的双质粒表达系统合成番茄红素。拷贝数不可控的双质粒表达系统采用组合优化策略,包括2种复制子(p15Aori和pBR322 ori)和2种启动子(T7和T7lac)的组合,构建出8个子模型。结果表明,利用此方法未能提高工程菌株的番茄红素生产能力,8株工程菌的番茄红素得率均低于3 mg/g DC W。二、整合型工程菌株联合质粒系统提高番茄红素合成水平。以具备优良生长性能的E.coliDH1基因组删减型菌株DH6为宿主,将参与番茄红素合成的3个操纵子以及T7 RNA聚合酶基因整合到宿主的基因组上,构建重组菌株DH411用于番茄红素的合成。试管中,整合型菌株DH411的番茄红素得率仅为0.66 mg/g DCW。其原因可能是合成番茄红素相关代谢途径需要进一步过表达。在菌株DH411基础上,利用质粒系统装载MVA下游途径和番茄红素合成途径能够显著提高番茄红素得率。随后,利用质粒表达系统比较不同来源的MVA下游途径操纵子和番茄红素合成途径操纵子,并优化质粒拷贝数。当把MVA下游途径调整为2拷贝后,获得菌株D111,番茄红素得率为27.43 mg/g DCW,且异源MVA途径拷贝数可控。三、基于MVA上游途径基因组多位点整合策略构建工程菌株。首先,探究MVA上游途径的整合位点对番茄红素合成的影响。以E.col/DH6T7为宿主,以整合位点为单变量,选择分布在基因组上不同区域的4个位点(64区、58区、44区和lpxM位点)。利用质粒pCANLEfG过表达MVA下游途径和番茄红素合成途径。结果表明,最优和次优的位点分别为58区和lpxM位点。以E.coliD111为宿主,分别将MVA上游途径整合到58区和lpxM位点,获得菌株D311和D511。菌株D311的番茄红素得率为29.57 mg/g DCW,而菌株D511具有更好的生长水平(OD600nm),分别是菌株D111和D311的2.0倍和2.2倍。随后,将58区和lpxM位点的优势结合,获得含3拷贝整合型MVA上游途径的工程菌株D711,番茄红素得率为34.52 mg/gDCW。并且,菌株D711的生长水平是D111的1.7倍。利用基因组多位点整合策略能够提高菌株番茄红素得率和生长水平。利用工程菌株的综合性能参数得出基因组多位点整合策略优于质粒表达系统。四、可控的代谢途径拷贝数模型联合基因组多位点整合策略构建具有整合型异源代谢途径的高产番茄红素工程菌株。利用可控的代谢途径拷贝数模型得到最优的子模型为1拷贝的MVA上游途径、2拷贝的MVA下游途径和3拷贝的番茄红素合成途径。基因组多位点整合策略是以番茄红素合成途径的整合位点为单变量,选取分布在基因组上不同区域的4个位点(8区、44区、58区和lpxM位点)。整合58区和lpxM位点能够分别提高番茄红素得率和生长水平。以此为基础,构建整合型工程菌株DH416,番茄红素得率为35.34 mg/g DCW,发酵水平为92.66 mg/L,OD600nm为7.09。优化诱导剂添加时间后,将番茄红素发酵水平提高到393.24 mg/L。利用5 L生物反应器培养20 h,番茄红素发酵水平为1.22 g/L,平均生产率(Mean productivity)为61.0 mg/L/h,达到目前文献报导最高水平。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q936;O629
【部分图文】：

胡萝卜素,隐黄素,萜类化合物,代谢途径

在已知的超过７００多种类胡萝卜素中，只有６种类胡萝卜素（番茄红素、ａ－逡逑胡萝卜素、（３－胡萝卜素、（３－隐黄素、玉米黄质和叶黄素）在人体的血清中含量较多［５２，５３］。逡逑如

基因,乳酸脱氢酶,烯醇式丙酮酸,磷酸

（乳酸脱氢酶－Ａ基因）、Ａｔ／Ｗ邋（乳酸脱氢酶基因）、（乙醇脱氢酶基因）、Ａｐ／ｗ邋（磷逡逑酸烯醇式丙酮酸合酶基因）和（乙酰辅酶Ａ：乙酰乙酰辅酶Ａ转移酶基因），将逡逑异戊二烯的发酵水平从９５６邋ｍｇ／Ｌ提高到１８３２邋ｍｇ／Ｌ。如图１．５，敲除Ａｏｃ／ｔ／ｌ－ｐｔｏ和ＡｐｏｘＳ逡逑可以防止醋酸的生成；敲除和Ａｏｃ／／７五分别阻止乳酸和乙醇的合成；敲除职＇逡逑阻止糖异生作用中丙酮酸向磷酸烯醇式丙酮酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ，邋ＰＥＰ）转化；敲除逡逑Ａａ／ｏＺ＾则阻止ＭＶＡ途径中间代谢物乙酰乙酰辅酶Ａ合成乙酰乙酸［５８】。逡逑Ｇｌｙｃｅｒｏｌ逡逑ｉ

工程图,融合酶,策略,工程

４）多种改造技术结合策略逡逑Ａｊｋｕｍａｒ等人［８（）］获得高产紫衫烯的五．ｃｏ／／？工程菌株后，为进一步催化紫衫烯生成逡逑ｔａＸａｄｉｅｎ－５ａ－0ｌ邋（图１．４），利用Ｎ－末端工程结合融合酶策略。如图１．６，对紫杉烯－５ａ－羟逡逑化酶的Ｎ－末端序列进行改造，并将它的ＣＰＲ氧化还原伴侣——来源于Ｔａｘ似的ＣＹＰ４５０逡逑还原酶（ＴＣＰＲ）的Ｎ－末端删减，再连接到改造后的紫杉烯－５ｃｘ－轻化酶的Ｃ－末端。将该逡逑融合酶基因转入高产紫衫烯五．ｃｏ／／工程菌株后，ｔａｘａｄｉｅｎ－５ａ－0ｌ的发酵水平为５８邋ｍｇ／Ｌ［８Ｑ］，逡逑是Ｄｅｊｏｎｇ等人［１１２］构建的工程酵母菌的２，４００倍。Ｔａｓｈｉｒｏ等人构建了蒎烯合成酶的突逡逑变体文库，结合定向进化和融合酶策略，达到目前利用五．ｃ0／／合成ａ－蒎烯的最高水平，逡逑利用摇瓶发酵２４邋ｈ，产量为１４０邋ｍｇ／Ｌ，是Ｓａｒｒｉａ等人［７８］的４倍。逡逑紫杉烯－Ｓａ－羟化酶逦ＣＹＰ４５0还原酶（ＴＣＰＲ邋）逡逑：逦Ｎ邋逦＼逡逑逦逦逡逑Ｎ末端逦ｒ逦Ｎ末端逦＾逡逑Ｏｆｔ—逡逑融合酶结合Ｎ末端工程逡逑图１．６融合酶策略结合Ｎ－末端工程逡逑Ｆｉｇ．邋１．６邋Ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ邋ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｎ－ｔｅｍｉｉｎａｌ邋ＴＭ邋ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，逡逑１．３．１．７邋ＣＩＣｈＥ邋策略逡逑利用质粒表达系统存在不稳定性

【参考文献】