氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用

发布时间：2017-04-05 07:11

  本文关键词：氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：氨基酸是蛋白质的基本单元，，是人体完成生理功能的必须物质。发展普适性广、灵敏度高、分离效能好、重复性优良的HPLC分析方法，一直是分析化学领域探索的重要课题。 分别以邻苯二甲醛(OPA)及2，4-二硝基氟苯(DNFB)为衍生化试剂，发展氨基酸的柱前衍生HPLC分析方法。考察了柱温、衍生试剂用量、反应时间及流动相pH值等因素对分析结果的影响。结果表明，柱温对分离选择性的影响很大，改变柱温甚至可能影响到氨基酸DNFB衍生产物(DNP-AA)的出峰顺序；衍生反应时间对OPA衍生氨基酸的定量分析影响显著。 为弥补单一色谱填料分离选择性的不足，通过对DNP-AA在6种不同C18填料上分离行为的考察，发展了“串联”和“混装”的色谱柱模式。采用C18-B与C18-SA串联的操作模式，可以使DNP-AA的分离选择性得到较大改善。而以C18-B和C18-SA填料混合装填色谱柱进行DNP-AA的分离，所得峰形、柱效等更佳。 基于发展的新方法，测定了啤酒、冬虫夏草等实际样品中的氨基酸，并对样品的预处理方法加以改进。结果表明，方法具有很好的普适性。
【关键词】：氨基酸 柱前衍生化 邻苯二甲醛 2 4-二硝基氟苯 新型HPLC柱
【学位授予单位】：南京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：O657.72
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 绪论9-21
• 1.1 氨基酸9-12
• 1.1.1 氨基酸的定义9
• 1.1.2 氨基酸的分类9-11
• 1.1.2.1 基本氨基酸9-10
• 1.1.2.2 根据旋光性分类10-11
• 1.1.2.3 根据酸碱性分类11
• 1.1.2.4 从营养学角度分类11
• 1.1.3 氨基酸的应用11-12
• 1.1.3.1 临床、医学方面的应用11
• 1.1.3.2 农业方面的应用11
• 1.1.3.3 食品方面的应用11
• 1.1.3.4 其它方面11-12
• 1.2 氨基酸HPLC分析12-19
• 1.2.1 氨基酸分析的发展12
• 1.2.2 氨基酸HPLC分析方法的分类12-13
• 1.2.2.1 直接分析法12
• 1.2.2.2 衍生化间接分析法12-13
• 1.2.3 氨基酸柱前衍生试剂13-19
• 1.2.3.1 柱前衍生试剂的一般要求13
• 1.2.3.2 主要柱前衍生试剂13-19
• 1.3 本论文的主要工作19-21
• 2 邻苯二甲醛(OPA)衍生氨基酸HPLC方法发展21-38
• 2.1 实验部分21-23
• 2.1.1 仪器21
• 2.1.2 试剂21
• 2.1.3 溶液的配制21-22
• 2.1.3.1 pH9.5硼酸缓冲溶液21-22
• 2.1.3.2 邻苯二甲醛(OPA)衍生化溶液22
• 2.1.3.3 氨基酸标准溶液22
• 2.1.3.4 0.1mol／L磷酸二氢钾溶液22
• 2.1.3.5 梯度洗脱溶液22
• 2.1.4 衍生方法22
• 2.1.5 色谱分析条件22-23
• 2.2 结果与讨论23-36
• 2.2.1 19种氨基酸的典型分离谱图23-25
• 2.2.2 分析系统重复性考察25-26
• 2.2.3 色谱柱温度对分析的影响26-28
• 2.2.3.1 色谱柱温度对保留时间的影响26-27
• 2.2.3.2 色谱柱温度对分离度的影响27-28
• 2.2.4 流动相pH值对分析的影响28-30
• 2.2.4.1 不同pH值对保留时间的影响28-29
• 2.2.4.2 不同pH值对分离度的影响29-30
• 2.2.4.3 不同pH值对峰面积的影响30
• 2.2.5 衍生物比例对分析的影响30-32
• 2.2.6 衍生反应时间对定量分析的影响32-33
• 2.2.7 紫外检测33-35
• 2.2.8 检测池中气泡对荧光检测的影响35
• 2.2.9 色谱柱的选择35-36
• 2.3 小结36-38
• 3 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生氨基酸HPLC方法发展38-56
• 3.1 实验部分38-40
• 3.1.1 仪器38
• 3.1.2 试剂38
• 3.1.3 溶液的配制38-39
• 3.1.3.1 2,4-二硝基氟苯衍生化溶液38
• 3.1.3.2 pH9.0硼酸缓冲溶液38-39
• 3.1.3.3 氨基酸标准品溶液39
• 3.1.3.4 pH7.0磷酸缓冲溶液39
• 3.1.3.5 梯度洗脱溶液39
• 3.1.4 衍生方法39
• 3.1.5 色谱分析条件39-40
• 3.2 结果与讨论40-55
• 3.2.1 20种氨基酸的典型分离谱图40-42
• 3.2.2 分析系统重复性考察42-43
• 3.2.3 衍生产物的稳定性43-45
• 3.2.4 衍生物比例对定量分析的影响45-46
• 3.2.5 衍生试剂的稳定性46-48
• 3.2.6 色谱柱温度对分析的影响48-50
• 3.3.6.1 色谱柱温度对各组分保留时间的影响48-49
• 3.2.6.2 色谱柱温度对各组分间分离度的影响49-50
• 3.2.7 流动相pH值的影响50-51
• 3.2.7.1 流动相pH值对各组分保留时间的影响50
• 3.2.7.2 流动相pH值对各种氨基酸面积的影响50-51
• 3.2.8 检测灵敏度、检测限与线性范围51-53
• 3.2.8.1 基线噪声51-52
• 3.2.8.2 灵敏度52
• 3.2.8.3 检测限52
• 3.2.8.4 线性范围52-53
• 3.2.9 定量回归曲线53-54
• 3.2.10 保护柱的影响54-55
• 3.3 小结55-56
• 4 新型HPLC柱的制备及氨基酸分析方法发展56-67
• 4.1 实验部分56-57
• 4.1.1 仪器与试剂56
• 4.1.1.1 仪器56
• 4.1.1.2 试剂56
• 4.1.2 实验方法56-57
• 4.1.2.1 氨基酸标准品的衍生化56
• 4.1.2.2 不同C18填料对氨基酸衍生产物选择性的考察56-57
• 4.1.2.3 串联色谱柱的连接及应用57
• 4.1.2.4 混装色谱柱的装填及应用57
• 4.2 结果与讨论57-66
• 4.2.1 6种不同品牌C18填料对DNP-AA的选择性57-61
• 4.2.2 串联色谱柱氨基酸分析方法发展61-63
• 4.2.2.1 填料选择依据61
• 4.2.2.2 串联色谱柱61
• 4.2.2.3 串联色谱柱分析氨基酸61-63
• 4.2.3 混装色谱柱氨基酸分析方法发展63-66
• 4.2.3.1 混装色谱柱63
• 4.2.3.2 混装色谱柱应用于常规分析63-64
• 4.2.3.3 混装色谱柱分析氨基酸64-66
• 4.3 小结66-67
• 5 应用67-75
• 5.1 游离氨基酸的测定67-70
• 5.1.1 啤酒中氨基酸的测定67-70
• 5.2 水解氨基酸的测定70-74
• 5.2.1 发酵虫草菌粉中氨基酸的测定70-72
• 5.2.2 奶粉中氨基酸的测定72-74
• 5.3 小结74-75
• 6 结论75-76
• 致谢76-77
• 参考文献77-85

【引证文献】

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