转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄对灰霉病抗性研究

发布时间：2017-10-14 09:02

  本文关键词：转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄对灰霉病抗性研究

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【摘要】：番茄是全世界消费量较高,栽培最为普遍的蔬菜作物之一,由灰霉菌引起的番茄灰霉病是造成番茄减产、品质下降的一种世界性重要病害,该病害已成为限制番茄高产、高质的主要因素之一。几丁质酶可水解大多数真菌细胞壁的主要成分几丁质,因而具有广谱抗真菌性,目前被广泛应用于植物抗真菌病害基因工程育种,培育抗真菌病害作物新种质。本研究构建了35S启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1,采用农杆菌介导的愈伤转化和茎尖转化两种转化方法导入Micro-Tom番茄中,通过筛选鉴定获得转基因植株,对其灰霉菌抗病性进行了分析。取得以下研究结果:1构建EuCHIT1植物表达载体及遗传转化番茄本研究以pCAMBIA1301为最初载体,采用一步克隆法构建了35S启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1表达元件、Hyg为筛选标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1。酶切及PCR验证后将其导入根癌农杆菌LBA4404,采用愈伤遗传转化方法转化番茄,筛选鉴定获得38株转基因植株。采用茎尖遗传转化方法转化番茄,PCR鉴定获得12株转基因植株。2 EuCHIT1基因表达对番茄几丁质酶活性的影响采用蜗牛酶法,对野生型和转EuCHIT1番茄植株中几丁质酶活性进行分析,结果表明,转EuCHIT1番茄植株中几丁质酶活性为2059.48 U·g-1,比野生型高62.14%。说明EuCHIT1基因在番茄中的表达可以增加番茄植株中几丁质酶活性。3 EuCHIT1基因表达对番茄灰霉病抗性的影响采用离体叶片接种法,对野生型和转EuCHIT1番茄接种灰霉菌,分析其发病时间和病斑大小。结果表明,野生型番茄叶片在接菌2 d后出现水浸状病斑,而转EuCHIT1番茄叶片在接菌4 d后才开始出现病斑。转EuCHIT1番茄叶片不仅发病时间比野生型推迟3 d,且在接菌4 d后,转EuCHIT1番茄叶片病斑直径平均为6.93 mm,而野生型叶片病斑直径平均为9.4 mm,转EuCHIT1番茄叶片上的病斑直径比野生型小26.28%。说明EuCHIT1在番茄中的表达提高了番茄对灰霉病的抗性。4 EuCHIT1基因表达对番茄保护性酶活性的影响分别对未接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和转EuCHIT1番茄SOD、POD、CAT活性和MDA含量分析表明,接菌前,转EuCHIT1番茄植株中POD活性为2825.85 U·g-1(FW),比野生型高48.63%;MDA含量为21.84 nmol·g-1(FW),比野生型低28.25%;而SOD和CAT活性与野生型相比无显著差异。接菌后,转EuCHIT1番茄植株中SOD、POD和CAT活性为510.44 U·g-1(FW)、5423.92U·g-1(FW)和603.59 U·g-1(FW),分别比野生型高19.48%、116.08%和53.80%;MDA含量为26.49 nmol·g-1(FW),比野生型低37.65%。说明EuCHIT1基因在番茄中的表达增强了番茄植株的抗氧化能力,从而减少灰霉病对番茄的损伤。5 EuCHIT1基因表达对番茄病程相关蛋白基因表达的影响对野生型和转EuCHIT1番茄接种灰霉菌,以番茄Clathrin adaptor complexes(CAC)基因作为内参,接菌6d后对接菌前、后野生型和转EuCHIT1番茄病程相关蛋白基因PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5 Real-time PCR分析表明,接菌前,转EuCHIT1番茄中PR-1a、PR-2和PR-5基因表达量均高于野生型,分别为野生型的2.23倍、11.69倍和1.80倍,PR-NP24表达量与野生型无显著差异;接菌后,转EuCHIT1番茄的PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5表达量也均极显著高于野生型,分别是野生型的4.35倍、10.37倍、16.58倍和5.02倍。表明EuCHIT1基因在番茄中的表达可以提高番茄植株中病程相关蛋白基因的表达,从而增强转基因番茄植株的抗病性。
【关键词】：杜仲 几丁质酶基因 番茄 灰霉菌 抗病性
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S436.412.13
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一章 文献综述10-24
• 1 番茄灰霉病研究进展10-18
• 1.1 番茄灰霉病病原菌10
• 1.2 番茄灰霉病侵染途径10-11
• 1.3 番茄灰霉病病症11
• 1.4 番茄灰霉病发生与危害11-12
• 1.5 番茄灰霉菌与寄主的互作机制12-14
• 1.6 番茄灰霉病防治措施14-17
• 1.7 番茄抗灰霉病育种17-18
• 2 杜仲抗真菌蛋白18-19
• 3 植物几丁质酶基因及其在植物抗病基因工程中的应用19-22
• 3.1 几丁质酶的酶学特性19
• 3.2 几丁质酶的活性诱导19
• 3.3 几丁质酶的生物功能19-21
• 3.4 几丁质酶在植物抗真菌病害基因工程中的应用21-22
• 4 Micro-Tom番茄适于功能基因组学研究的特征及其应用22-23
• 4.1 Micro-Tom番茄适于功能基因组学研究的特征22
• 4.2 Micro-Tom番茄在基因功能鉴定中的应用22-23
• 5 本研究的目的和意义23-24
• 第二章 EuCHIT1植物表达载体构建及对Micro-Tom番茄的遗传转化24-44
• 1 材料24-27
• 1.1 实验材料24
• 1.2 主要试剂及配方24-25
• 1.3 主要仪器及设备25-26
• 1.4 主要培养基26-27
• 2 方法27-34
• 2.1 植物表达载体的构建27-32
• 2.2 农杆菌感受态细胞的制备及DNA转化32-34
• 3 EuCHIT1对Micro-Tom番茄的遗传转化34-37
• 3.1 农杆菌的培养及活化34-35
• 3.2 Micro-Tom番茄无菌苗的获得35
• 3.3 农杆菌介导的Micro-Tom番茄愈伤组织遗传转化35-36
• 3.4 农杆菌介导的Micro-Tom番茄茎尖遗传转化36
• 3.5 转基因植株的PCR鉴定36-37
• 4 结果与分析37-42
• 4.1 植物表达载体酶切鉴定37-39
• 4.2 农杆菌质粒PCR鉴定39
• 4.3 农杆菌介导的Micro-Tom番茄愈伤组织遗传转化及PCR鉴定39-41
• 4.4 农杆菌介导的Micro-Tom番茄茎尖遗传转化及PCR鉴定41-42
• 5 讨论42-44
• 第三章 转EuCHIT1番茄植株的抗病性检测44-59
• 1 材料44-45
• 1.1 主要试剂及配方44-45
• 1.2 主要仪器及设备45
• 2 方法45-51
• 2.1 EuCHIT1基因表达对番茄几丁质酶活性影响的测定45-46
• 2.2 灰霉菌分生孢子悬浮液的制备46
• 2.3 转EuCHIT1番茄对灰霉病的抗性鉴定46-47
• 2.4 转EuCHIT1番茄保护性酶活性的测定47-49
• 2.5 病程相关蛋白基因表达分析49-51
• 3 结果与分析51-56
• 3.1 EuCHIT1基因表达对番茄几丁质酶活性的影响51-52
• 3.2 EuCHIT1基因表达对番茄灰霉病抗性的影响52-54
• 3.3 EuCHIT1基因表达对番茄保护性酶活性的影响54-55
• 3.4 EuCHIT1基因表达对番茄病程相关蛋白基因表达的影响55-56
• 4 讨论56-59
• 第四章 结论、创新与展望59-61
• 1 结论59-60
• 2 创新60
• 3 展望60-61
• 参考文献61-75
• 附录75-76
• 致谢76-77
• 声明77-78

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