中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpUIRP2和VpUIRP3的表达分析

发布时间：2017-11-10 03:26

  本文关键词：中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpUIRP2和VpUIRP3的表达分析

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【摘要】：葡萄是全球范围内栽培面积较广和经济效益较高的水果之一。世界主栽欧洲葡萄(V.vinifera L.)品种品质优,但其突出缺点是不抗病,尤其不抗葡萄白粉病。研究葡萄抗病基因,对欧洲葡萄进行定向转基因改良是解决这一生产问题的有效途径。我国是葡萄种属的起源地之一,拥有大量的野生抗病种质资源,前期研究报道了中国野生华东葡萄白河-35-1株系(V.pseudoreticulata accession Baihe-35-1)具有较强抗病性,尤其是抗葡萄白粉病。本研究从以白河-35-1为材料构建的中国野生华东葡萄抗白粉病基因cDNA文库中筛选到两条RING型泛素连接酶基因ETS序列,经过同源克隆获得了基因编码区序列,分析了基因的表达特性及转基因欧洲葡萄的抗病能力,主要取得以下结果:1.同源克隆获得中国野生华东葡萄泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的编码区序列(CDS)。VpUIRP2定位在五号染色体上,CDS序列为954 bp,编码317个氨基酸,GenBank登录号为KU519335;VpUIRP3定位在8号染色体上,CDS序列为1641 bp,编码546个氨基酸,GenBank登录号为KU519336。VpUIRP2和VpUIRP3都具有C3H2C3型中RING finger保守结构域。2.对中国野生华东葡萄白河-35-1接种白粉菌,VpUIRP2和VpUIRP3受白粉菌诱导后表达上调,分别在24 h和6 h达到表达高峰,说明VpUIRP2和VpUIRP3的表达响应白粉菌诱导。对中国野生华东葡萄白河-35-1进行水杨酸处理,VpUIRP2和VpUIRP3的表达上调,均在3 h达到表达高峰,说明VpUIRP2和VpUIRP3的表达响应水杨酸的处理。将两个基因分别与pBI221-GFP载体融合,构建亚细胞定位载体,转化拟南芥原生质体,亚细胞定位结果表示VpUIRP2蛋白定位在细胞质,VpUIRP3蛋白定位无特异性。3.优化了无核白(V.vinifera cv.Thompson Seedless)、红地球(V.vinifera cv.R ed Globe)、赤霞珠(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)器官发生再生体系。比较了不同BAP浓度的萌芽培养基对无核白、红地球愈伤组织萌芽成枝的影响,结果表明诱导一个月时,无核白使用BAP浓度为8.8μmol·L-1的IM培养基效果最好,红地球使用B AP浓度为4.4和8.8μmol·L-1的IM培养基效果最好;诱导两个月时,红地球和无核白使用BAP浓度为4.4和8.8μmol·L-1的IM培养基效果最好。比较了不同BAP和NAA浓度对赤霞珠愈伤组织诱导的影响,结果表明,赤霞珠愈伤组织诱导最适合的培养基组合为IM1C培养基(IM+2.668 mg·L-1 BAP),IM2培养基(IM+4.000mg·L-1 BAP)和IM3C培养基(IM+7.336 mg·L-1 BAP)。4.将VpUIRP2和VpUIRP3通过农杆菌介导法遗传转化红地球、无核白。得到13个转化VpUIRP2红地球抗性株系,2个转化VpUIRP3红地球抗性株系,2个转化VpUIRP2无核白抗性株系,2个转化VpUIRP3无核白抗性株系。PCR检测结果显示,11个转化VpUIRP2红地球株系,2个转化VpUIRP2无核白株系能检测到1154bp的目的条带,Southern检测结果显示4个转化VpUIRP2红地球抗性株系,1个转化VpUIRP2无核白抗性株系为阳性株系,阳性率为33.3%。结果表明,VpUIRP2转入了红地球、无核白中。VpUIRP3抗性株系未检测到目标条带。5.对转基因株系接种白粉菌,表型观察转基因株系的白粉菌生长情况弱于野生株系,苯胺蓝染色结果与孢子数统计分析结果表明,168 h转基因株系中分生孢子数与每毫克叶片中孢子总数均显著低于野生对照,说明转基因株系的抗白粉病能力强于未转基因的野生型红地球和无核白葡萄植株。中国野生华东葡萄白河-35-1泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3能增强葡萄对白粉病的抗性,可以作为抗病基因,用于改良欧洲葡萄的抗病性研究。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.631

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