蛹虫草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因表达调控、抗体制备及蛋白表达检测

发布时间：2017-12-07 17:05

  本文关键词：蛹虫草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因表达调控、抗体制备及蛋白表达检测

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【摘要】：生物体内都存在自身能够控制生理节律的生物钟。生物钟蛋白FRQFREQUENCY(FRQ)、蓝光受体White Colar-1(WC-1)和White Colar-2(WC-2)是真菌生物钟系统中核心振荡器的三个重要成分,它们在生物钟负反馈调节系统中发挥着非常重要的作用。本论文以蛹虫草(Cordyceps militaris)F411为实验材料,对蛹虫草中生物钟基因Cmfrq(Cordyceps militaris frq)、蓝光受体基因Cmwc-1(Cordyceps militaris wc-1)和Cmwc-2(Cordyceps militaris WC-2)的表达调控进行了分析,制备了生物钟蛋白CmFRQ(Cordyceps militaris FRQ)、蓝光受体CmWC-1(Cordyceps militaris WC-1)和Cm WC-2(Cordyceps militaris WC-2)的抗体,并用制备的抗体对蛹虫草中的蛋白表达情况进行Western blotting检测。为了研究Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达调控情况,本实验设计了不同的蛹虫草培养条件,利用实时荧光定量PCR技术检测不同条件下的Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达。结果表明,在不同条件下Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达不同。Cmfrq基因相对表达量最高,Cmwc-2基因其次,Cmwc-1基因最低。当蛹虫草菌丝体从黑暗条件下转入到光照条件下时,frq基因的转录水平都会上升,这种现象与粗糙脉胞菌中相同。畸形子实体比正常的子实体存在一个更高的Cmfrq表达量。但蛹虫草中Cmwc-1和Cmwc-2基因表达量的差异,预示着蛹虫草中复合体结构可能不同于粗糙脉孢菌中的WCC结构。Cmwc-1的表达主要集中在子实体的中下段部分,而Cmwc-2的表达集中在在子实体的顶端和中段部分,这表明在子实体的中间部分可能会更多地形成CmWC-1/CmWC-2复合体结构,这种现象推测与子实体的向光性和伸长有关。通过生物信息学分析,设计引物对Cmfrq部分序列(1561-2727 bp)、Cmwc-1部分序列(1549-2772 bp)和Cmwc-2部分序列(394-1179 bp)进行PCR扩增。将目的片段与质粒pET-41a(+)连接后,转化到BL21(DE3)感受态细胞,然后用IPTG进行诱导表达。表达成功的融合蛋白分子量大小分别为74 kDa、76 kDa和64 kDa。所有的表达蛋白经过纯化后用作抗原,制备出了抗体anti-CmFRQF、anti-CmWC-1A和anti-CmWC-2B。CmFRQ蛋白还采用了另外一种方法制备抗体,首先化学合成三条CmFRQ抗原决定簇短肽FRQ1、FRQ2和FRQ3,偶联载体蛋白后作为抗原制备抗体anti-FRQ1、anti-FRQ2和anti-FRQ3。分别提取蛹虫草菌丝体和子实体的总蛋白,用制备的抗体进行Western blotting分析。结果表明,anti-FRQ2始终可以检测到蛹虫草菌丝体和子实体中特异的50 kDa(CmFRQ50)和31 kDa(CmFRQ31)蛋白质杂交带。在子实体中在40 kDa和50 kDa之间还存在两条杂交带。此外,菌丝体和子实体的不同生长时期,CmFRQ50和CmFRQ31蛋白质相对含量会出现变化,表明生物钟蛋白CmFRQ的存在形式可随着蛹虫草的生物学性状变化而发生变化。anti-CmFRQ在Western blotting中可检测到菌丝体中的CmFRQ100,但CmFRQ100在子实体中不能检测到。CmWC-1在菌丝体和子实体中存在不同的形式:菌丝体中存在CmWC1-42和CmWC1-48两种形式,而在子实体中只存在CmWC1-42一种形式,推测CmWC1-48含有LOV结构域。蛹虫草F411的CmWC-2在菌丝体和子实体中存在相同的形式CmWC2-50。本研究初步分析了Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达调控关系,并检测了CmFRQ、CmWC-1和CmWC-2在蛹虫草中的存在形式,这对进一步研究蛹虫草的生物钟系统提供了依据。
【学位授予单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.35;Q78

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本文编号：1263094