反刍兽月形单胞菌β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

发布时间：2018-02-01 00:49

  本文关键词： 反刍兽月形单胞菌 β-木糖苷酶 毕赤酵母 异源表达 酶学性质　出处：《生物工程学报》2017年05期 　论文类型：期刊论文

【摘要】：β-木糖苷酶(β-xylosidase,酶编号EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系中的重要组成部分。本研究以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主菌尝试表达反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium中的β-木糖苷酶基因Sxa。根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、mRNA二级结构、GC含量和稀有密码子,对Sxa基因进行优化;通过基因合成技术获得了全长基因mSxa并构建重组酵母表达载体pPIC9K-mSxa;以BglⅡ酶切重组载体pPIC9K-mSxa,电击转化将m Sxa基因导入毕赤酵母GS115中,获得的转化子经过表型和遗传霉素G418抗性筛选、PCR鉴定,得到表达β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-mSxa;通过活性测定获得高效表达β-木糖苷酶的重组酵母,并对重组β-木糖苷酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明,重组β-木糖苷酶的分子量约为66 kDa。在发酵罐水平表达的酶活性达到了287.61 IU/mL。对酶学性质研究显示,该酶在温度为40-60℃,pH为5.0-7.0时较稳定,其最适反应温度和pH分别为55℃和6.0,专一性地作用于β-木糖苷键。Mn~(2+)和Ca~(2+)对该酶具有激活作用,而Fe~(3+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次将反刍兽月形单胞菌的β-木糖苷酶基因转化到毕赤酵母中获得表达,并具有较高活性,为进一步工业化应用奠定了基础。
[Abstract]:尾 -xylosidase. Enzyme No. EC 3.2.1.37). It is an important component of xylan degrading enzyme system. In this study, Pichia pastoris was used in Pichia pastoris. Expression of Selenomonas by GS115 as host strain. The 尾 -xylosidase gene Sxa. in ruminantium is based on the preference of Pichia pastoris for codon. MRNA secondary structure GC content and rare codon were optimized for Sxa gene. The full-length gene mSxa was obtained by gene synthesis and the recombinant yeast expression vector pPIC9K-mSxa was constructed. The recombinant vector pPIC9K-mSxa was digested with Bgl 鈪，

本文编号：1480458