表达融合蛋白APB-DOCK8转基因番茄防龋疫苗免疫SD大鼠的实验研究

发布时间：2018-02-27 22:58

  本文关键词： 转基因番茄 龋病 疫苗 防龋 SD大鼠　出处：《遵义医学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:在获得质粒pET30a-PAcA以及外源基因APB-DOCK8转基因番茄T_0代种子的基础上,制备相应的蛋白抗原多克隆抗体,应用PCR、Western、ELISA等技术对转基因番茄果实和植株进行鉴定,对其融合蛋白含量、表达融合蛋白转基因番茄口服免疫动物诱导的特异性抗体和防龋效果进行检测。方法:本研究包括三个部分第一部分:重组质粒p ET30a-PAc A原核表达、蛋白纯化以及抗体制备1、获得含有重组质粒p ET30a-PAc A的转化子(E.coli BL21(DE3)),并加入IPTG诱导蛋白表达。2、裂解诱导后的菌体,过Ni-NTA纯化柱,纯化鉴定诱导的蛋白。3、PAcA蛋白免疫新西兰大白兔,取血,分离血清,获得目的蛋白的多克隆抗体。第二部分:APB-DOCK8转基因番茄果实的基因鉴定和融合蛋白的检测1、本实验对如何获得高浓度的番茄果实DNA进行了探索,比较了改良CTAB法和植物DNA提取试剂盒法两种方法的效果,通过对转基因番茄进行GUS检测,筛选含有外源基因APB-DOCK8的植株。2、采用BCA法对提取的转基因T_0、T_1代番茄果实的总蛋白进行定量;ELISA法检测转基因T_0、T_1代番茄果实中融合蛋白浓度;Western blot分析融合蛋白的表达情况。与前期课题组构建的未加入番茄果实特异性启动子E8转基因番茄的数据进行比较,重点观察融合蛋白的表达变化。第三部分:表达融合蛋白APB-DOCK8转基因番茄口服免疫SD大鼠的实验研究1、动物选择及分组:24只18 d龄SD大鼠,雌性,按随机分组原则分为:阳性对照组8只,实验组8只和阴性对照组8只,建立龋齿模型。2、免疫方式、抗原及剂量:实验组以10 m L/kg剂量喂食含融合蛋白的转基因番茄汁(含融合蛋白365.52μg)进行免疫,阴性对照组按10 m L/kg剂量喂食正常组非转基因番茄果汁,而阳性对照组喂食S.mutans UA159灭活全菌疫苗(每次1 m L,菌液浓度为1×109 CFU/m L)。3、免疫时间:从24 d开始,SD大鼠每周免疫一次,连续4周。4、样品采集:第一次免疫前1 d及每次免疫7 d(直至12 w)后采集唾液、血液样本,其中9 w、11 w不采集。5、特异性抗体的检测:用间接ELISA法检测唾液中SIgA和血清中IgG的水平。6、处死SD大鼠后取重要脏器进行病理学检查;取上下颌骨,根据Keyes经典评分方法进行龋齿计分。结果:1、优化原核表达蛋白的条件,得到纯化的可溶性BL21/p ET30a-PAc A蛋白,测定出该蛋白的浓度为0.5616 mg/m L,并制备出该蛋白的多克隆抗体。2、提取转基因番茄果实DNA时,改良CTAB法比试剂盒法更为适用。GUS方法检测转基因番茄,显示20株转基因番茄植株中有15株出现特异性条带,占总植株的75%。3、转基因T_0、T_1代番茄果实总蛋白浓度分别为13.57 mg/m L、13.43 mg/m L;ELISA法检测T_0、T_1转基因番茄果实的融合蛋白浓度分别为41.372μg/m L、36.552μg/m L。其外源融合蛋白所占的比例分别为0.3048%、0.2722%。同时Western印迹显示转基因番茄蛋白提取样本出现了85 KD大小的特异性条带,其大小正好符合APB融合蛋白预计大小。4、实验组和阳性对照组免疫后7 d检测发现:动物血清中IgG和唾液SIgA抗体水平呈逐渐升高趋势;抗体在第6 w升至最高峰,第7-8 w较为平稳,第8 w抗体水平开始明显降低。在0-12 w实验组特异性SIg A抗体和阳性对照组之间差异无统计学意义(P0.05);实验组特异性Ig G除在10 w与阳性对照组比较差异有统计学意义(P0.05),其他时间点均无统计学意义;在1-10 w阳性对照组和实验组各特异性抗体水平与阴性对照组比较均有统计学意义。阳性对照组与实验组龋损比较,除Ds级外其余各级无统计学差异(P0.05),阳性对照组和实验组的龋齿计分与阴性对照组有统计学差异(P0.05)。5、一般安全性检测:相同时间点各组SD大鼠的体重比较差异无统计学意义(P0.05)。阳性对照组、实验组和阴性对照组主要脏器未见明显的病理学改变。结论:1、重组质粒p ET30a-PAc A能成功表达出可溶性的BL21/p ET30a-PAc A蛋白。成功制备了抗PAc A多克隆抗体,为下一步的转基因番茄目的蛋白检测提供了实验基础。2、T_1代转基因番茄植株中筛选出含有外源目的基因APB-DOCK8的阳性植株。T_0、T_1代番茄果实内融合蛋白APB-DOCK8表达时发生断裂,但检测APB蛋白成功表达,且表达阳性率和表达效率都较高,APB蛋白的表达较为稳定。3、APB-DOCK8转基因番茄作为口服疫苗具有较好的免疫原性,免疫SD大鼠后,能诱导黏膜免疫和全身免疫反应,在唾液和血液中均产生特异性抗体,并能在一定程度上减少龋齿的发生。同时免疫动物后未观察到明显的危害产生。
[Abstract]:Objective: Based on plasmid pET30a-PAcA and APB-DOCK8 gene T_0 generation of transgenic tomato seeds, protein antigen to prepare polyclonal antibody, PCR, Western, ELISA and other techniques to identify fruit and plant transgenic tomato, the fusion protein content, expression of fusion protein in transgenic tomato oral immunization induced by specific animal antibody and anti caries effects were detected. Methods: This study includes three parts: the first part: the recombinant plasmid P ET30a-PAc A prokaryotic expression, protein purification and antibody preparation of 1 transformants obtained with the recombinant plasmid P ET30a-PAc A (E.coli BL21 (DE3)), and.2 protein expression induced by IPTG cleavage after the induction of cell, Ni-NTA purification column, purification and identification of induced protein.3, PAcA protein immunized New Zealand rabbits, blood, serum separation, polyclonal antibody to protein. The second part: AP B-DOCK8 transgenic tomato fruit gene identification and fusion protein was detected in 1, this study explores how to obtain tomato fruit by high concentrations of DNA, the kit method two different extraction methods of modified CTAB method and compare the effect of plant DNA, through GUS detection of transgenic tomato plants, screening.2 containing APB-DOCK8 gene. BCA was used to extract the total protein of T_1 generation transgenic T_0 tomato fruit quantitative detection of genetically modified T_0; ELISA method, fusion protein concentration T_1 in tomato fruit; Western blot analysis of the expression of the fusion protein. Construction and early research group did not add the tomato fruit specific promoter E8 transgenic tomato and compare the data expression of fusion protein, were observed. The third part: the expression of APB-DOCK8 fusion protein in transgenic tomato oral immunization of SD rats 1 experimental study animal and grouping: 24 鍙，

本文编号：1544685