Brugada综合征SCN5A基因突变G1712C的功能表达研究

发布时间：2018-03-02 17:21

本文选题：Brugada综合征　切入点：SCN5A基因　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究背景:Brugada综合征(Brugada syndrome,BrS)是一种罕见的遗传性心律失常综合征,具有心电图表现为右胸导联V1-V3持续性ST段抬高和高心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)风险特征。本病因发生晕厥或心源性猝死概率高,且与青壮年猝死高度相关而日益引起人们的重视。典型心电图表现为右胸前导联(V1-V3)ST段抬高≥22mm,可继发T波倒置,而QT间期正常。发作时心电图表先为极短配对间期室性期前收缩、多形室速、室颤,而体格检查和辅助检查(胸片、心脏彩超、心脏MRI等)均无心脏器质性病变证据。Brugada综合征的流行病学特征目前尚无明确资料,但亚洲和东南亚国家明显高于其他国家,达0.5/1000-1/1000。在亚洲的某些地区,Brugada综合征是导致50岁以下青年男性自然死亡的最常见原因。近年的相关研究表明,Brugada综合征的发病机制与许多基因突变密切相关,尤其是编码人类心脏钠通道α亚单位的SCN5A基因的突变,其机理可能是SCN5A基因的突变导致心脏钠通道蛋白的功能障碍。二、目的:为进一步探讨Brugada综合征离子、细胞电生理的发病机制,本研究拟通过对本课题组前期发现的Brugada综合征基因SCN5A新突变G1712C进行功能表达研究。三、方法:分两部分进行,第一部分:对含有相关SCN5A基因(G1712C)突变片段采用定点诱变PCR进行扩增,HindⅢ和XbaⅠ酶进行质粒酶切鉴定法构建质粒,DNA序列测定来鉴定定点诱变是否成功。第二部分:先应用脂质体转染法得到稳定表达的hβ1细胞系,然后再将hβ1细胞分别瞬时转染至野生型、突变型两种质粒。细胞转染后于37℃恒温箱中孵育48小时,然后再取生长良好的细胞分别进行膜片钳检测。构建pcDNA3.1-GFP-SCN5A突变体质粒,通过脂质体Lipofectamine 3000分别将pcDNA3.1-GFP和pcDNA3.1-GFP-SCN5A突变体质粒转染至在对数生长期HEK293细胞中,转染36小时后再在荧光显微镜下观察转染效率,然后激光共聚焦显微镜(leica TCSSP8)下观察绿色荧光蛋白在转染细胞的分布情况。四、结果:成功构建了含有SCN5A基因突变G1712C的pcDNA3.1(mpcDNA3.1)表达重组体。在激光共聚焦显微镜下,观察到GFP-SCN5A突变体(G1712C)主要在细胞质的外周(细胞膜)中分布,突变位点成功定位到了细胞膜上。在野生型pcDNA3.1瞬时转染的细胞系中,指令电位从-60 mV逐渐上升时,钠电流也渐变大,在-20 mV时完全激活;激活电压在-60 mV到-50 mV之间,反转电位在50 mV左右。在G1712C瞬时转染突变型的细胞系中,未记录到钠电流。五、结论:野生型pcDNA3.1表达的Nav1.5通道蛋白与正常心肌细胞Nav1.5通道电生理特征一致。SCN5A基因G1712C突变导致Nav1.5通道失去功能,可能是该家系Brugada综合征的病因。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541.7

【参考文献】