稻曲病菌侵染水稻无雄蕊突变体的显微结构分析及激活水稻灌浆相关基因的初步

发布时间：2021-04-02 20:16

水稻稻曲病(rice false smut,RFS)是由半知菌亚门绿核菌属绿核菌引起的一种水稻穗部真菌病害,分布广泛,危害严重。不仅危害粮食产量,其产生毒素还危害人畜健康。近年来,该病害逐步上升为我们水稻新三大病害之一。关于稻曲病的研究也越来越多,但对于稻曲病的发病机理仍有许多未解之谜。最近研究表明,稻曲病菌特异侵染水稻花丝形成稻曲球,但也有研究者认为花药和柱头也可能被侵染。对于花丝是否是稻曲病菌的唯一或必须侵染位点仍不明确。此外,我们前期研究中发现稻曲病菌侵染水稻颖花导致受精灌浆被阻断、不能形成种子,但水稻灌浆相关基因被上调表达。由此猜测稻曲病菌侵染水稻后可能劫持水稻的灌浆系统,将营养用于稻曲球生长。基于此,本论文利用显微切片技术对一个无雄蕊突变体水稻进行稻曲病菌侵染过程观察,并对稻曲病菌激活水稻灌浆相关基因的分子机制开展研究。主要取得了以下研究结果：(1)稻曲病菌能够成功侵染无雄蕊突变体水稻,并形成稻曲球,说明花丝并不是稻曲病菌成功侵染水稻颖花所必须的。(2)通过树脂切片分析,发现稻曲病菌能够侵染无雄蕊突变体水稻的子房及柱头分支。(3)通过对稻曲球进行透射电子显微镜分析,发现被稻曲病菌侵染后的水稻子房细胞出现类似正常灌浆子房细胞中的囊泡结构,暗示稻曲病菌侵染水稻颖花激活水稻灌浆过程。(4)为了明确水稻灌浆基因的激活是否是发病进程中的重要环节,我们鉴定了灌浆缺陷突变体水稻gif1、risbzl和pdil-1,下一步将对其进行稻曲病菌接种,分析发病进程及稻曲球形成的变化。同时,我们构建了种子灌浆相关基因融合报告基因的转基因水稻,为明确稻曲病菌激活水稻灌浆基因的时空特征提供了材料基础。(5)利用荧光素酶双报告系统筛选出三个能够激活灌浆相关基因OsRISBZl的稻曲病菌效应因子：UvGFA(Ustilaginoidea virens grain filling actor) 1,UvGFA2,UvGFA3。目前,正对这三个效应子进行转基因功能验证。(6)利用本生烟瞬时表达系统对稻曲病菌效应因子进行亚细胞定位研究,发现Uv_1214等15个效应因子定位在核上和膜上,Uv_1114等6个效应因子定位在膜上和质体上,Uv 1324等7个效应因子定位在膜上,效应因子UvGFA3则呈点状分布。综上所述,本研究通过对无雄蕊水稻突变体进行稻曲病菌人工接种,发现在没有花丝的情况下稻曲病菌也能够侵染水稻并形成稻曲球,突变体子房和柱头分支可被侵染,说明花丝并不是稻曲病菌的唯一侵染位点。稻曲病菌侵染水稻颖花不仅激活灌浆相关基因的表达,而且使感病子房细胞中出现类似灌浆子房细胞中的囊泡结构。稻曲病菌可能通过分泌效应因子UvGFA1,UvGFA2,UvGFA3调控水稻灌浆基因的表达,从而劫持营养库。本研究揭示了稻曲病菌侵染水稻的新途径,提出了稻曲病菌侵染水稻形成稻曲球的特殊机制,对认识与防控稻曲病具有重要意义。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.111.4

文章目录

摘要

Abstract

1 文献综述

1.1 稻曲病研究现状

1.1.1 稻曲病的发生与危害

1.1.2 稻曲病的侵染机制

1.1.3 稻曲病分子生物学研究进展

1.1.4 稻曲病的综合防治

1.2 病原菌效应因子研究现状

1.2.1 植物免疫机制

1.2.2 调控植物免疫的效应因子

1.2.3 调控植物代谢的效应因子

1.3 论文的选题依据及意义

2 稻曲病菌侵染水稻无雄蕊突变体的显微结构分析

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 稻曲病菌菌株

2.1.3 培养基的配制

2.1.4 主要试剂配制

2.1.5 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 稻曲病菌菌种保存

2.2.2 稻曲病菌菌种活化与接种体制备

2.2.3 人工接种稻曲病菌

2.2.4 取样

2.2.5 光学显微镜（LM）和透射电子显微镜（SEM）制样观察

2.3 结果与分析

2.3.1 稻曲病菌侵染无雄蕊突变体水稻形成稻曲球

2.3.2 半薄切片观察分析

2.3.3 超薄切片观察分析

3 稻曲病菌激活水稻灌浆相关基因的初步研究

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料、实验样品、稻曲病菌菌株

3.1.2 水稻遗传转化所用的载体和菌

3.1.3 主要试剂配制及试剂盒

3.1.4 主要培养基

3.1.5 主要仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 稻曲病菌菌种保存、菌种活化与接种体制备、人工接种稻曲病菌、取样、透射电子显微镜制样观察

3.2.2 水稻DNA提取

3.2.3 载体构建

3.2.4 大肠杆菌和农杆菌感受态制备

3.2.5 大肠杆菌化学转化和农杆菌电击转化

3.2.6 农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株阳性鉴定

3.2.7 本生烟瞬时表达

3.2.8 GUS染色

3.2.9 稻曲效应因子亚细胞定位

3.2.10 荧光素酶双报告系统检测（DLR）

3.3 结果与分析

3.3.1 稻曲病菌-子房界面细胞壁及囊泡结构观察

3.3.2 水稻种子灌浆缺陷突变体的鉴定

3.3.3 构建种子灌浆相关基因融合报告基因的转基因水稻

3.3.4 筛选鉴定能激活水稻灌浆相关基因OsRISBZ1的稻曲病菌效应因子

3.3.5 稻曲病菌效应因子的亚细胞定位分析

4 全文总结与讨论

4.1 稻曲病菌侵染水稻无雄蕊突变体子房与柱头分支

4.2 稻曲病菌激活水稻灌浆相关基因

参考文献

致谢

附录Ⅰ 本实验所用引物

附录Ⅱ 本实验中涉及基因ID

硕士在读期间发表的学术论文

【参考文献】