刺参盐度调节相关基因的定量表达及组织学分析

发布时间：2018-04-02 00:30

  本文选题：刺参　切入点：盐度相关基因　出处：《大连海洋大学》2016年硕士论文

【摘要】：刺参(Apostichopus japonicus)主要分布于我国北方沿海地区,已成为我国海水养殖品种产值最高的种类之一,具有很高的营养价值和丰富的经济效益。刺参养殖池塘多位于潮间带,夏季暴雨、旱季蒸发、冬季冰冻、潮汐变化等都会引起养殖池塘海水盐度发生剧烈变化。因此开展盐度对刺参生理、生化以及分子调控机制的研究,以了解刺参的盐度适应过程,有助于刺参遗传育种工作的进一步开展。本文通过测定盐度胁迫下刺参生理生化指标,观察各器官组织学的变化,研究盐度相关基因表达量的变化,Na~+/K~+-ATPase基因的组织定位情况,为刺参盐度适应性的研究工作奠定基础,同时为培育耐低盐刺参品系提供科学参考。试验模拟雨季环境,盐度变化分为三个阶段:第一阶段模拟突降大雨,盐度由正常海水盐度以每6小时降3个盐度的速度降至盐度18;第二阶段模拟低盐环境下不换水的情况,盐度维持在18时保持96小时;第三阶段养殖池塘换水期,盐度由18以相同速度升至正常盐度,并保持24小时。结果显示,各时间点刺参体腔液渗透压、体腔液总蛋白浓度、Na~+、K~+、Cl 浓度与盐度的变化趋势一致。Na~+、K~+、Cl 浓度均在盐度下降到18时达到最低值,而Ca~(2+)浓度在胁迫过程中持续上升。体腔液中Na~+/K~+-ATP酶活力在盐度18并保持4天后显著高于其他组(P0.05),这一系列变化反应了Na~+/K~+-ATP酶在刺参盐度适应过程中起关键作用。盐度胁迫对谷丙转氨酶活力无显著影响。不同盐度胁迫下刺参各器官组织学变化的研究结果表明,盐度对刺参的管足、肠和纵肌影响最为显著。从组织学变化可以看出随着盐度的降低,组织的完整性破损程度越显著,所有组织器官的损伤程度随时间的延长更加恶化。在低盐18,23,27胁迫下,刺参肠道、肌肉和管足出现了明显的组织损伤。在低盐度18和23胁迫下,刺参肠道结缔组织受到损伤,且部分与黏膜上皮层分离。在管足组织上有明显的变化,在低盐18下,管足组织出现明显损伤,结缔组织肿胀,纵肌破裂。在高盐40下,刺参管足组织呈脱水状态。盐度18和23胁迫下的呼吸树组织中的内寄生纤毛虫数量减少甚至消失。结果显示低盐胁迫对刺参造成的影响较高盐显著。利用刺参盐度胁迫转录组文库数据,从获得的403个差异表达基因中筛选出10个物质跨膜运输相关的盐度相关基因(水通道蛋白、钙转运ATP酶、F型H~+-ATP酶、Na~+/K~+-ATP酶、电压门控性钾离子通道、钙激活氯通道、神经乙酰胆碱受体α-9亚基、钠-氯依赖型SNP家族、甘氨酸受体α亚基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸),进行实时定量PCR分析。结果表明,不同基因在不同组织中表达情况存在较大差异。Na~+/K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATPase在肠道、呼吸树组织中的变化趋势一致,均在6小时达到最高值,说明了这两个基因可能是协同发挥作用的。钠-氯依赖性SNF家族(Slc6a13)和甘氨酸受体(Gly R)都属于神经传导受体,这两个基因在刺参低盐胁迫过程中各组织的表达量和变化趋势基本一致。利用原位杂交的技术手段,研究低盐胁迫下Na~+/K~+-ATPase基因在刺参各组织的阳性杂交情况,结果表明Na~+/K~+-ATPase基因表达在特定的环境条件下具有组织特异性。在呼吸树结缔组织中均未出现Na~+/K~+-ATPase阳性杂交位点,说明刺参的呼吸树结缔组织不是Na~+-K~+泵发挥作用的主要场所。胁迫过后触手组织出现了Na~+/K~+-ATPase基因的阳性位点,刺参的结缔组织与肌肉层连接间隙有阳性位点,这一结果与管足组织的研究结果近似,这两种组织都是属于刺参的水管系统,可能在刺参盐度适应过程中发挥重要作用。
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本文编号：1698005