CYP11B1基因新突变致11β-OHD一例家系研究

发布时间：2018-04-08 13:05

本文选题：CYP11B1基因　切入点：11β-OHD　出处：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景:先天性肾上腺增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)是一组由于控制肾上腺皮质醇和皮质酮合成的各种酶缺乏导致的常染色体隐性遗传疾病。CAH患者根据不同的酶缺陷而有非常广泛的临床表现谱,这些酶包括21-羟化酶,11β-羟化酶,3β-羟类固醇脱氢酶,17α-羟化酶等[1]。11β-羟化酶缺陷症(11β-hydroxylasedeficiency,11β-OHD)是CAH的第二大原因,占CAH5-8%,在非近亲结婚人群中发病率约为1:100 000-1:200 000[2]。1 1β-OHD根据临床症状严重程度及酶活性的缺陷程度分为经典型和非经典型。典型的11β-OHD引起特征性的皮质醇合成减少。皮质醇缺乏反馈性增加促肾上腺皮质激素(ACTH)增加,引起肾上腺皮质增生,伴随类固醇前体物质增加,从而促进雄激素合成通路亢进。过多的肾上腺来源雄激素导致女性男性化、假两性畸形、男性假性性早熟。皮质酮通路受阻导致11-去氧皮质酮(1 1-Deoxycorticosterone,DOC)及其代谢物积聚,这些物质具有盐皮质激素活性,从而导致钠潴留及容量扩张[3]。编码11β-羟化酶的基因CYP11B1位于8q24.3,包含9个外显子。该基因长5.4kb,功能上与合成醛固酮(ALD)的CYP11B2基因相似。这两个基因具有95%的序列同源性,相距约40kb。与21-羟化酶患者中基因型与表型具有良好的相关性不同,在11β-OHD患者中很难预测突变对酶活性及临床表型的影响,这与11β-OHD患者数量较少,难以形成大规模研究有关[4]。但是,CYP11B1基因分析可以协助确诊11β-OHD以及有助于遗传咨询。研究目的:本研究采集了一例高血压伴低血钾患者,明确患者为经典型11β-OHD。对患者及其家系进行CYP11B1基因分析,发现了一种剪接突变。利用实时荧光定量PCR技术明确患者遗传形式;利用小基因技术,通过质粒构建体外表达mRNA,明确该剪接突变对mRNA的影响。研究方法:通过实验室及影像学检查结合患者家系资料收集,达到临床诊断11β-OHD目的。用EDTA抗凝管留取患者及家系外周血,利用试剂盒提取外周血单个核细胞DNA。根据基因文库中CYP11B1基因序列,利用软件primerpremier 6.0设计引物分别扩增各个外显子区域及外显子-内含子交界区域。分别使用患者及父母DNA为模板扩增,目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化后,利用ABI 3130xl基因测序仪测序,并利用Autoassembler2.0软件将测序结果与UCSC数据库下载的基因组序列进行比对,从而找出突变位点。基因测序结果显示患者为纯合点突变,母亲为杂合点突变,父亲未发现突变位点,因此推测患者CYP11B1基因存在父源的大段缺失突变。为此,我们设计引物通过围绕基因点突变两侧扩增,产物为150bp,通过荧光实时定量PCR技术对该片段拷贝数定量。此外,由于该突变为剪接突变,为明确突变对mRNA剪接的影响,我们利用小基因技术,通过质粒构建并导入工程细胞中来体外表达,明确突变对mRNA剪接的影响。研究结果:1.临床诊断:患者临床确诊为经典型11β-OHD。患者家系成员中父亲、母亲、哥哥、姐姐均表型正常。2.患者及家系突变检测结果:(1)Sanger测序显示患者CYP11B1基因c.595+1GA纯合形式突变。该突变为剪接突变,经初步生物信息学分析(Augustus)明显影响mRNA剪接。患者母亲、姐姐携带c.595+1GA杂合突变,父亲该位点未见异常。3.荧光实时定量PCR检测结果:发现目的片段存在杂合缺失,该片段跨越第3外显子3'端和第3内含子5'端,包含突变位点。4.突变对mRNA剪接的影响:琼脂糖凝胶电泳显示患者组mRNA逆转录后的cDNA较对照组长100bp左右。经过基因测序发现,突变型mRNA较野生型多出了第3内含子序列,提示该剪接突变导致第3内含子滞留,从而影响蛋白编码及酶结构。
[Abstract]:The study background : congenital adrenal hyperplasia ( CAH ) is a group of autosomal recessive inherited diseases caused by various enzymes that control the synthesis of adrenocorticotropic hormone ( CAH ) . These enzymes include 21 - hydroxylase , 11尾 - hydroxylase , 3beta - hydroxysteroid dehydrogenase , 17伪 - hydroxylase , etc . The gene CYP11B1 , which encodes 11 尾 - hydroxylase , is located at 8q24 . 3 . It contains 9 exons . The gene has a length of 5.4 kb and is functionally similar to the CYP11B2 gene of synthetic aldosterone ( ALD ) . The gene has a sequence homology of 95 % . It has a good correlation with genotype and phenotype in 21 - hydroxylase patients . It is difficult to predict the effect of mutation on enzyme activity and clinical phenotype in 11尾 - OHD patients . This is related to the number of 11尾 - OHD patients , and it is difficult to form large - scale research . Genetic analysis of CYP11B1 gene was carried out by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( PCR ) .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R586

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