水稻黑条矮缩病抗性QTL（qRBSDV-6d、qRBSDV-6e、qRBSDV-6f）的筛查与转基因初步鉴定

发布时间：2018-04-23 15:29

本文选题：水稻黑条矮缩病 + 抗性基因　；参考：《南京农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：水稻黑条矮缩病病原为水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV),由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久、非经卵方式传播,是当前稻麦轮作区乃至全国稻区最为严重的病毒病害。RBSDV不仅侵染水稻,还可侵染玉米和小麦,分别引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病和小麦绿矮病,受害植株均表现矮缩、叶色浓绿、结实率低等症状。培育抗性品种是控制水稻黑条矮缩病最为经济有效的手段,但RBSDV抗性基因的分离鉴定研究进展缓慢,为此,本研究以抗性品种乌壳构建的F2群体为对象、SLAF-seq(specific length amplified fragment sequencing)技术构建高密度遗传连锁图谱,结合人工接种鉴定方法评价抗性表型,精细定位了 RBSDV抗性QTL(quantitative trait locus),在此基础上,对其中3个抗黑条矮缩病QTL(qRBSDV-6d、qRBSDV-6e、qRBSDV-6f)进行候选基因的筛查和转基因鉴定,期望分离出抗性基因位点,主要研究结果如下:1.借助水稻全基因组测序Gramene数据库、生物信息学和高通量测序报告(http://www.gramene.org/;http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/;http://www.uniprot.org/),对 3 个抗性QTLs区段存在的295个候选基因进行基因注释和电子筛查,重点筛选R基因和防卫相关的抗病基因。最终,共筛查出27个R基因和29个防卫相关基因。其中,R基因中有3个NBS-LRR、18个类受体蛋白激酶(LRR-RLK、lectin-RLK、PR-RLK、RLK)、2个蛋白激酶(STK、CDPK)、1个脯氨酸富集蛋白、1个转录因子和2个翻译起始因子(eIF2)等;在防卫相关基因中,11个参与防卫反应信号转导,调节防卫基因表达(MAPK激酶、蛋白质磷酸化酶、锌指蛋白、磷脂酰肌醇、钙调蛋白),6个参与结构抗病(POD),5个参与蛋白质的降解(E3泛素蛋白连接酶)和4个抗病蛋白类似物等。2.设计引物,通过PCR从抗病亲本乌壳和感病亲本淮稻5号中扩增候选基因,共克隆出41个候选基因,包括20个R基因和21个抗病相关基因。测序结果表明,在抗病品种乌壳和感病品种淮稻5号中存在氨基酸差异的候选基因有23个。InterPro数据库和SMART网站,分析氨基酸差异对结构或功能域的影响,发现10个候选基因的氨基酸差异发生在结构和功能域中,或改变结构域种类。同时,为进一步验证这些候选基因氨基酸差异的稳定性,在后代F2代极抗和极感单株中进行克隆测序,发现其在F2代抗感群体中发生了遗传交换,仍然存在稳定的氨基酸差异。3.基于双重验证和功能预测的结果,本研究最终选择了 5个候选基因,分别为:编码LRR-RLK的R06和R08、编码STK的R22、编码U-box E3泛素连接酶的P01、编码PHD锌指蛋白的P02,插入经改造的以玉米泛素Ubi为启动子,以潮霉素基因为选择标记的植物双元表达载体pCAMBIA1301,构建植物转化载体,经农杆菌介导的方法将目的基因转化至感病亲本淮稻5号,生成转基因植株。对得到的转基因株系R08、P01、R22、R06和P02进行阳性植株的检测,通过PCR的方法先进行潮霉素基因检测,后通过分子测序检测目的基因,最终分别得到22、8、24、28和38个转基因阳性植株,为以后的深入研究奠定了材料基础。同时,为了明确分离出的RBSDV抗性基因对玉米粗缩病可能的抗性,本研究在接种中引入灰飞虱有效接种量的概念,优化和完善了玉米粗缩病人工接种鉴定的最适条件,为后续抗性基因的功能分析提供方法上的保证。
[Abstract]:The results were as follows : 1 . Three NBS - LRR , 18 receptor protein kinases ( LRR - RLK , lectin - RLK , PR - RLK , RLK ) , two protein kinases ( STK , CDPK ) , 1 proline - enriched protein , 1 transcription factor and 2 translation initiation factors ( eIF2 ) were selected . Based on the results of double validation and functional prediction , we found that there were 23 candidate genes , including 20 R genes and 21 disease resistance genes .

【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.111

【参考文献】