穿心莲内酯生物合成中萜烯合酶基因的克隆及功能鉴定

发布时间：2018-04-26 07:52

本文选题：二萜 + ent-柯巴基焦磷酸合酶　；参考：《四川农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：穿心莲具有清热解毒、凉血、消肿的功效,是很好的抗菌消炎药。其主要的药效成分为二萜类化合物穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯,但其生物合成途径仍不清楚。穿心莲内酯的生物合成非常复杂,催化生成半日花烷型母核结构的ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,简称ApCPS)是其关键限速酶。近期有报道,从穿心莲中克隆得到了一个(TPS基因(GenBank:JN216843.1),但其功能并未得到验证。本研究从植物体内和体外两个方面来鉴定该CPS的功能。ApCPS作为穿心莲内酯生物合成途径中的早期调控基因,鉴定其生物功能可助我们了解穿心莲内酯类生物合成机制,也为将来利用该基因调控穿心莲内酯的生物合成,提高穿心莲的药效和规范化生产打下基础。本研究以种植在人工气候室的穿心莲为材料,使用RT-PCR检测ApCPS的组织特异性表达,采用TLC和HPLC法测定各组织中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。利用大肠杆菌代谢工程鉴定ApCPS在体外的功能,并通过定点突变及生物信息学分析确定ApCPS的催化活性位点；在植物体内采用VIGS沉默ApCPS基因,作者采用RACE技术克隆得到了一个穿心莲中的八氢番茄红素脱氢酶基因(ApPDS)作为VIGS的报告基因,通过RT-PCR和qRT-PCR分析基因沉默的效果及穿心莲内酯生物合成上游关键酶3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR),1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)以及牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)的基因表达情况,并使用HPLC法检测ApCPS沉默后穿心莲内酯积累量的变化。同时,为了深入分析ApCPS在穿心莲内酯生物合成的功能,作者还检测了在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导下ApCPS及其上游相关基因的表达模式。本论文的主要研究结果如下：1.ApCPS在各组织中均表达,在叶、茎中表达较高,根中表达最低,和穿心莲内酯在各组织中的积累情况一致。MeJA能诱导ApCPS表达强烈上调,穿心莲内酯生物合成上游基因HMGR、DXS、GGPS也受MeJA诱导表达上调,并且响应时间要早于ApCPS,表明穿心莲内酯生物合成基因受到MeJA的广泛调控。2.作者从穿心莲幼苗中克隆得到了ApCPS基因,重组表达确定ApCPS催化GGPP生成ent-CPP。将其保守域DXDD进行定点突变后,ApCPS失去催化活性,表明DXDD执行催化功能。对ApCPS序列分析发现其DXDD上游具有保守的精氨酸,表明其可能参与到次生代谢而不是初生代谢。3.用RACE技术从穿心莲中克隆得到ApPDs,该cDNA全长2224 bp,预测有一个1752 bp的完整开放阅读框(序列已登录GenBank,登录号为：KP982892),编码584个氨基酸。序列同源性分析表明ApPDS与芝麻、广藿香、黄芩等其他植物的PDS有很高的同源性,该蛋白包含一个共有的氨基酸脱氢酶的辅酶结构域NAD(H)-binding domain。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析,结果表明PDS基因在穿心莲的根、茎、叶、花中均有表达,表达量为叶花茎根。4.用VIGS方法在穿心功莲体内鉴定ApPDS的功能,构建VIGS载体pTRV2-PDS,经农杆菌浸染穿心莲叶片,植物表型观察到叶片轻微变黄,qRT-PCR检测到ApPDS基因下调,表明VIGS技术在穿心莲植株体内被成功运用。5.利用VIGS在穿心莲叶片中沉默ApCPS,使其基因表达下调了49.80%,并且ApCPS基因的沉默负反馈调节GGPS的表达,对HMGR.DXS的表达没有影响。HPLC法检测到ApCPS沉默15d后穿心莲内酯积累量下降了53.52%。通过植物体内和植物体外两方面的研究,鉴定了ApCPS的功能是参与到穿心莲内酯生物合成,催化GGPP生成ent-CPP作为穿心莲内酯生物合成的母核结构；并且在穿心莲体内运用VIGS成功沉默了ApCPS基因,使穿心莲内酯的积累量显著减少,为研究穿心莲内酯生物合成途径中其他基因的功能奠定了基础。
[Abstract]:ApCPS was used as the early regulatory gene in the biosynthesis of andrographolide and its biological function was not validated . The study was carried out in vitro and in vitro to determine the content of andrographolide and dehydroandrographolide . The study was conducted to identify the activity of apCPS in vitro by using the method of TLC and HPLC .
The gene expression of ApCPS and its upstream related genes were determined by RACE technique .
In addition , the ApCPS gene is successfully silenced by using VIGS in Andrographitis , and the accumulation amount of andrographolide is reduced significantly , which lays a foundation for studying the function of other genes in andrographolide biosynthesis pathway .

【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.219

【参考文献】