自噬基因Beclin-1在不同临床时期胃癌组织的表达与临床意义研究

发布时间：2018-05-22 12:01

  本文选题：自噬 + 胃癌　； 参考：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景胃癌作为消化道恶性肿瘤中最常见的一类恶性疾病,胃癌的发生涉及众多与基因、蛋白等相关的微观原因。在我国消化道恶性肿瘤的发病率中连续数年高居榜首,每年新发病例数目相当巨大,而且我国的胃癌发生率和死亡率也在世界上位居第三位,城市居民癌症死亡率中胃癌的死亡率位于第二位,农村居民癌症死亡率中胃癌的死亡率位于第一位[1,2];胃癌的死亡率在恶性肿瘤死亡率中占首位。我国作为全球范围内胃癌发病率最高的国家,由于我国农村居民人口众多,农村经济文化水平与城市之间存在巨大的落差,这使得农村人群接受的教育程度、医疗条件和经济条件相对较差,导致我国的胃癌具有一些独特的自身特点:农村地区人口的胃癌发病率和死亡率均明显高于城市人口。而在发病部位方面,相对于最常见于小弯侧和幽门区域的胃癌而言,发生于胃食管结合部腺癌(贲门癌)的发病率正呈现出逐年上升的趋势[3-6]。胃癌因其恶性程度高、进展期肿瘤预后较差、严重威胁人类的健康。研究发现关于胃癌发生的分子机制包括抑癌基因失活,癌基因活化,细胞周期调节失控,细胞信号转导通路异常等多种相关因素,但是关于胃癌的发病具病因和相关体机制仍然存在着诸多疑问和大片的空白,亟待相关研究人员进行不断而深入的探索。此外,关于胃癌发生机制的研究对于胃癌的早期诊治也具有非常重要的意义[7]。自噬泛指溶酶体(lysosomes)介导的细胞质降解过程,正常情况下,机体的细胞很少会发生自噬,但是饥饿、氧化应激、损伤、能量代谢缺乏等来自细胞内外的代谢压力能够诱导自噬发生,细胞内外的各种刺激作用于细胞,诱导胞浆中内质网、高尔基体、线粒体来源的杯形具有双层膜结构的自噬前体的形成,导致自噬水平显著升高,促进细胞内物质的循环利用,并且自噬体的膜也会脱落并进行再循环和重复利用。自噬具有极为重要的生物学意义,它是维持细胞代谢活动平稳进行的主要贡献者之一。当外源性的营养物质、能量缺乏,不足以维持正常代谢时,自噬的有序进行可以为机体提供内源性的营养物质和能量,保证细胞在严峻的生存条件下得以存活。而且自噬还在机体细胞的成分更新、组织的代谢、生长及发育等一些列重要的生命基本进程中起到非常重要的生物学作用[8]。此外,自噬也与人体的许多疾病发生、发展关系密切,例如神经退行性疾病,Danon肌病等[9,10]。自噬是所有真核细胞生命和代谢活动中的一个较为普遍生物学现象,因此也参与肿瘤细胞的生命和代谢活动。自噬在癌症发生和发展的进程中发挥的作用相当复杂,我们不能简单的认为自噬能够促进肿瘤的发生发展或抑制癌变的发生,例如自噬对细胞内线粒体具有一定的隔离作用,这种自发的隔离作用可在一定程度上防止促凋亡因子的扩散,帮助机体细胞逃避凋亡;抑制机体自噬可使机体的蛋白降解变缓慢,合成代谢增加,从而导致癌前病变细胞持续生长。目前有许多研究已经证实,自噬在胃癌的发生、发展中可能起到了重要的作用,但是其在胃癌发生、发展过程中更为具体的作用机制,以及是否能对实际的临床工作具有指导意义仍然是未知数。在哺乳动物中与细胞自噬功能相关的基因里,Beclin-1是第一个在哺乳动物细胞中被发现的自噬相关基因,其产物既可以介导自噬蛋白定位于自噬前体结构,也是参与机体自噬体形成调控的关键基因,与多种肿瘤的发生、发展密切相关。Beclin-1不仅可以促进真核细胞自噬功能的活化,同时也参与细胞凋亡的调节。究证实Beclin-1除了能够发挥调节自噬水平的作用之外也是一种明确的抑癌因子。Beclin-1等位基因的缺失和突变与肝癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等世界范围内较为常见的且致死率较高的恶性疾病的发生发展过程密切相关[11-14]。但是这些疾病发生的内在的机制是否与自噬这一过程直接相关仍有待进一步深入的探讨。目前已有的对Beclin-1基因在自噬过程中调控作用的研究表明,这一基因的产物可以通过与Ⅲ型PI3K(phosphatidylinositol 3,kinase)等自噬过程中的关键位点结构结合形成一个全新的复合物结构,进而完成对于其他的ATG蛋白激活或抑制的微观调控,影响ATG蛋白在自噬前体结构中的相对空间位置,最终完成该基因对自噬的有效调控作用。而另外一种对于自噬具有重要意义的分子结构即为微管相关蛋白轻链3(micro-tubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)。LC3是一种在哺乳动物细胞中发现的,与酵母中的自噬相关基因Atg8是同一来源的类似物。LC3-Ⅱ是LC3的存在形式之一,与LC3的另一种存在形式LC3-Ⅰ的分布部位不尽相同,LC3-Ⅱ主要存在于自噬体的双层膜结构之上,是一种对于自噬研究非常重要的标记物,可以通过对于LC3-Ⅱ的检测和观察,从而判断是否发生自噬和评估自噬的水平。目的本文将从多方面阐述自噬基因Beclin-1与不同时期胃癌组织之间的关联,并深入探究Beclin-1在癌症发生、发展过程中的作用机制,以及对IFN-γ对胃癌细胞的作用和作用机制进行探究,为临床上治疗胃癌寻找靶点提供理论依据。方法(1)选取2013年6月至2014年9月间于吉林大学中日联谊医院普通外科行胃癌根治术后所得的胃癌组织标本共75例,其中16例属于胃癌Ⅰ期,40例属于胃癌Ⅱ期,19例属于胃癌Ⅲ期,然后使用免疫组织化学、RT-PCR技术和Western Blot进行检测,分别检测Beclin-1和IFN-γ在胃癌组织标本中的m RNA表达与蛋白的水平。应用流式细胞仪检测技术分析分泌IFN-γ的免疫细胞百分比。(2)Western Blot检测Beclin-1在BGC-823和MKN-28两个细胞株及正常胃粘膜上皮细胞株GES-1中的表达水平。半定量RT-PCR检测成其中中Beclin-1的m RNA表达;CCK-8检测IFN-γ对BGC-823细胞株增殖的影响,Western Blot和半定量RT-PCR检测IFN-γ分别作用于BGC-823细胞后,检测自噬标志物LC3、Beclin-1的m RNA表达与蛋白的水平。分析Beclin-1在不同胃癌中的表达水平对细胞凋亡调控机制,为此检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Casepase3的m RNA表达与蛋白的水平。(3)取雌性BALB/c裸鼠,在无特定病原体条件下进行饲养,自由饮食。构建啮齿动物异种移植瘤模型,将生长到指数生长期的胃癌细胞(BGC-823)皮下接种到小鼠背部。14天后处死小鼠,得到肿瘤后将其研磨后接种于新的裸鼠的右侧腋窝下,最终得到异种移植瘤模型。将小鼠随机分为空白对照组和IFN-γ干预组,连续每天测量和记录肿瘤的直径和小鼠的存活状态。Western blot检测小鼠体内肿瘤组织细胞的LC3和Beclin-1的蛋白水平。结果1.癌症早期(TNM分期为Ⅰ和Ⅱ期),胃癌组织中的自噬相关基因Beclin-1也有较高水平表达。Beclin-1高水平表达这种类似的变化并没有在癌症晚期(TNM分期为Ⅲ期)的癌组织中观察到。癌旁细胞的Beclin-1表达维持在一个稳定水平,组织样本中分泌IFN-γ的免疫细胞在癌症分化程度较好的细胞中高表达。以上结果表明胃癌组织内的Beclin-1、IFN-γ的表达水平可能与癌症分期呈负相关。2.Beclin-1在MNK-28中表达最高,正常胃癌细胞GES-1内大于BGC-823中的表达,且各组间差异显著(P0.05),INF-γ治疗后BGC-823细胞株的LC3的表达和Beclin-1的表达都显著增加,细胞增殖能力下降,凋亡相关蛋白表达水平也随之发生改变。3.INF-γ治疗后肿瘤组织的LC3的表达和Beclin-1的表达都显著增加,INF-γ组异种移植肿瘤组织的体积明显小于对照组;INF-γ处理4周后与对照组相比裸鼠体重和存活率都出现明显升高。结论1.自噬与胃癌的病理分期有密切关系,在胃癌的发生发展中起到重要的作用。Beclin-1,INF-γ与胃癌的病理特征之间有密切关系。Beclin-1在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌组织标本中有较高水平表达,而在Ⅲ期胃癌组织标本中表达较前两期低。2.INF-γ与胃癌的发生发展也关系密切,在IFN-γ刺激后的胃癌细胞和组织中的自噬相关基因Beclin-1和LC3表达量增加。3.自噬相关基因Beclin-1与胃癌的分化程度和浸润深度有着密切联系,与是否发生淋巴结转移无明显关联。4.INF-γ诱导激活自噬后可以抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡而抑制肿瘤的生长,能够明显的缩小肿瘤体积、延长荷瘤小鼠的存活期。
[Abstract]:Gastric cancer is the most common type of gastric cancer in the world . The incidence and mortality of gastric cancer in our country are significantly higher than those in the urban population . Autophagocytosis is a process of cytoplasmic degradation mediated by lysosomes . In normal conditions , the cells of the organism can induce autophagy , but starvation , oxidative stress , damage , and lack of energy metabolism can induce autophagy . Beclin - 1 plays an important role in the pathogenesis and development of gastric cancer . Beclin - 1 plays an important role in the pathogenesis and development of gastric cancer . LC3 - 鈪，

本文编号：1921969