猪Beclin1基因调控PRV增殖的作用与机理的研究

发布时间：2018-05-25 10:43

  本文选题：PRV + 细胞自噬　； 参考：《华中农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是α疱疹病毒亚科的重要成员之一。伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由PRV感染引起,会导致怀孕母猪流产、呼吸和神经系统障碍以及仔猪死亡。细胞自噬是机体维持内环境稳定的一种程序性死亡,机体利用自噬抵抗外来病原微生物入侵;此外,细胞自噬一般伴随着细胞凋亡的发生,调控细胞凋亡的蛋白也可以调控细胞自噬。本研究在PRV感染PK15细胞中,利用免疫印迹(WB)方法,检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术和WB方法,探讨PRV感染细胞的凋亡水平;利用自噬抑制或诱导剂调控细胞自噬水平,探讨自噬对PRV增殖的影响,利用RT-q PCR和WB检测Beclin1、Bcl-2和Bcl-x L的转录和翻译水平;最后利用免疫共沉淀实验分析PRV感染PK15细胞中Beclin1与抗凋亡家族蛋白Bcl-2和Bcl-x L的结合水平。主要研究结果如下:1.PRV感染诱导细胞自噬,可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路PRV感染PK15细胞导致LC3-Ⅱ蛋白的表达明显增多,表明PRV感染诱导了LC3-Ⅰ蛋白脂化成LC3-Ⅱ蛋白;且P62蛋白表达量也极显著下降,进一步表明PRV感染可以诱导细胞自噬。除此之外,还检测了细胞自噬的主要信号通路PI3K-Ⅰ/AKT,结果显示AKT蛋白表达水平无明显变化,但其S473位点磷酸化水平显著减少。2.PRV感染诱导细胞凋亡,同时激活Caspase-9和Caspase-8蛋白利用流式细胞术检测了细胞凋亡,结果显示PRV感染可诱导细胞凋亡;同时,利用了WB检测PRV感染Caspase-9和Caspase-8剪切水平,结果表明Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-8表达水平都显著地上调。3.细胞自噬抑制PRV增殖分别利用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapa干扰自噬水平,探讨其对病毒增殖的影响。研究结果表明,3-MA有效地抑制细胞自噬,PRV非结构蛋白g E和TK基因m RNA水平、病毒衣壳蛋白VP26表达水平都显著地增加;Rapa有效地诱导细胞自噬时,显著地抑制病毒衣壳蛋白VP26表达水平。4.PRV感染抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-x L结合进而促进细胞自噬RT-q PCR和WB技术检测结果表明,PRV感染自噬相关蛋白Beclin1的m RNA和蛋白水平显著增加;Bcl-2的m RNA水平在感染6小时前呈现显著上升、感染6小时后具有下降(12h、24h和36h)的趋势,在蛋白水平呈现极显著上升趋势;Bcl-x L在m RNA水平呈现极显著上升(6h、12h和24h)后下降(36h)的趋势,在蛋白水平呈现极显著上升趋势。本研究利用免疫共沉淀的方法检测了与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白Bcl-2和Bcl-x L,研究结果表明PRV感染Beclin1能与Bcl-2和Bcl-x L结合,但结合的水平明显减弱。
[Abstract]:Pseudorabies virus (PRV) is one of the important members of 伪 herpesvirus subfamily. Pseudorabies is caused by PRV infection, which can cause abortion, respiratory and nervous system disorders, and piglet death in pregnant sows. Autophagy is a programmed death of the body to maintain the stability of its internal environment. Autophagy is used by the body to resist the invasion of foreign pathogenic microorganisms. In addition, autophagy is usually accompanied by apoptosis. Proteins that regulate apoptosis also regulate autophagy. In this study, the level of autophagy in PK15 cells infected with PRV was detected by Western blotting method, and the apoptotic level of cells infected with PRV was studied by flow cytometry and WB methods. The effect of autophagy on PRV proliferation was studied by regulating autophagy level with autophagy inhibition or inducer. The transcription and translation levels of Bcl-2 and Bcl-x L in Beclin1 were detected by RT-q PCR and WB. Finally, the binding level of Beclin1 with anti-apoptotic family proteins Bcl-2 and Bcl-x L in PK15 cells infected with PRV was analyzed by immunoprecipitation assay. The main results were as follows: 1. The expression of LC3- 鈪，

本文编号：1933146