来源于澳大利亚链球菌的高抗草甘膦aroA基因的克隆及酶学特性研究

发布时间：2018-05-27 19:44

  本文选题：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 + 澳大利亚链球菌　； 参考：《上海师范大学》2016年硕士论文

【摘要】：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EC 2.5.1.19)是莽草酸途径(参与合成芳香族氨基酸的主要途径)第六步反应的关键酶,催化莽草酸-3-磷酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成无机磷和5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate,EPSP)。该酶是植物和微生物的芳香族氨基酸合成必不可少的酶。草甘膦作为一种目前世界上应用最普遍的广谱、非选择性除草剂是该酶的抑制剂,它竞争取代PEP和酶、S3P形成三聚体结构(Aro A-S3P-草甘膦)。然而,草甘膦是广谱灭生性除草剂对农作物也有影响。所以,为促进草甘膦工业的发展和降低农业产业成本和提高生产效率,对具有草甘膦耐受性或能降解草甘膦农作物的研发与推广显得尤为重要。一般5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶被分为两类。类型Ⅱ的Aro A与类型Ⅰ序列一致性在30%左右。并且,类型ⅡAro A在草甘膦存在时,相对于类型ⅠAro A表现出较高的催化效率。不过,2015年一种来源于恶臭假单胞菌4G-1的aro A基因表达的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶被分为第三类Aro A。自从1970s Aro A受到关注,随着分子生物学技术的快速发展和对Aro A的深入研究,很多抗草甘膦aro A基因不符合转基因的要求,比如,对PEP的亲和性低。我们实验室先前研究中,具有高抗草甘膦(400 m M)和高亲和PEP的来源于费氏中华根瘤菌NGR234(Sinorhizobium fredii NGR234)的Aro A。根据Willcox的研究,基因aro A S.australis的来源菌-澳大利亚链球菌可以在浓度高达500m M生长。我们的表达产物Aro A S.australis有很多不同于别的Aro A的特性。比如该酶的最适p H 7.5-8.0明显高于来源于大肠杆菌(p H5.5-6.0)、克雷伯氏菌肺炎(p H5.4和6.8)和核盘菌(p H7.2),然而与本实验室先前研究来源于中华根瘤菌EPSP酶接近(p H8.0)。除此之外,当酶Aro A S.australis在梯度p H缓冲液中处理,其在较广的缓冲范围中表现出一定的稳定性。因此证明,该酶可以在极端环境下保持稳定,尤其是应用在碱性土壤中。该酶的最适温度是室温30℃。研究中不同于其他Aro A,很多一价金属离子对该酶的基本没有影响,而是有二价镁离子、二价锰离子和二价锌离子对该酶有一定的抑制影响,但也不是很明显。抗草甘膦实验数据显示,草甘膦的浓度达150 m M时,Aro A S.australis与对照一样被完全影响。以上数据显示,来源于澳大利亚链球菌的Aro A为抗草甘膦转基因作物的理论提供了更好的选择。
[Abstract]:5 - Enolylshikimic acid - 3 - phosphate synthase ( EC 2.5 . 1.19 ) is a key enzyme for the sixth - step reaction of shikimic acid pathway ( main pathway involved in the synthesis of aromatic amino acids ) , the production of inorganic phosphorus and 5 - enols pyruvate - 3 - phosphate ( EPSP ) by catalytic shikimic acid - 3 - phosphate ( S3P ) and phosphoenol pyruvate ( PEP ) . The enzyme is an essential enzyme for the synthesis of aromatic amino acids of plants and microorganisms . As one of the most common broad - spectrum applications in the world , glyphosate is an inhibitor of the enzyme , which competes for the formation of trimeric structures ( Aro A - S3P - glyphosate ) in place of PEP and enzyme , S3P . However , it is very important to develop and promote glyphosate tolerance or degradation of glyphosate crops . In addition , when the enzyme Aro A S.averalis is treated in a gradient p - H buffer , it exhibits a certain stability in a wide range of buffers . It is therefore demonstrated that the enzyme can be stable under extreme conditions , especially in alkaline soils . The enzyme has a certain inhibitory effect on the enzyme , but it is not significant .
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q93
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本文编号：1943511