密码子优化及生物砖方法提高ZEN降解酶基因在毕赤酵母中的表达

发布时间：2018-05-31 08:23

  本文选题：玉米赤霉烯酮 + 密码子优化　； 参考：《湖北大学》2016年硕士论文

【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌属真菌产生的一种非固醇类雌激素真菌毒素,最初由Stob等从发霉玉米中分离得到。ZEN在世界各地的谷物及其副产品中污染广泛,在玉米、大麦、小麦等谷物及其副产品中经常能检测到ZEN。ZEN通过污染的谷物农副产品及饲料进入食物链,并在人体与动物体内累积。进入人体与动物体内的ZEN会引起雌激素综合症状,导致动物体内雌激素过多,引起不孕不育,并有很强的致癌性和基因毒性。ZEN在谷物饲料中的污染,不仅在全球造成了巨大的经济损失,同时也威胁到人体健康。为了保障食品安全,对真菌毒素ZEN的脱毒技术具有重大的意义。传统的物理化学方法并不能有效地去除谷物中的毒素,并会破坏谷物的营养成分,影响食物的口感。酶降解不仅可以高效的将ZEN转化为无毒性产物,安全环保,而且酶催化反应专一性强、降解效率高,不会破坏谷物的营养物质。2002年,Takahashi-Ando等从粉红粘帚霉中克隆得到ZEN降解酶基因zhd101并在大肠杆菌表达验证,重组酶能有效地酶降解ZEN。但是,目前zhd101表达得到的酶液降解ZEN的效率都比较低,也还没有通过基因优化、构建多拷贝等策略提高zhd101在毕赤酵母中表达量的报道。本论文将ZEN降解酶基因zhd101按照毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化,人工合成优化后的基因序列zhd。同时,通过生物砖方法体外构建了 zhd基因1-4拷贝毕赤酵母表达质粒pHBM905BDM-zhd。用Sal分别将1-4拷贝重组质粒线性化,电转化毕赤酵母Ppastoris GS115感受态细胞,得到含有zhd基因不同拷贝数的重组毕赤酵母菌株,将含有1-4拷贝的重组酵母菌株分别命名为X1c、X2c、X3c、X4c。摇瓶发酵诱导显示,随着拷贝数的增加,ZHD蛋白表达量逐渐增加,当增加到四拷贝时,X4c菌株ZHD的表达量开始降低了。重组酵母菌株X1c、X2c、X3c、X4c的ZHD蛋白表达量分别为 0.03 mg/mL、0.062 mg/mL、0.083 mg/mL、0.058 mg/mL。并且首次定义 ZHD 降解ZEN的酶活单位U,纯化过后的ZHD蛋白降解ZEN的酶活为42.3 U/mL,比酶活为4976.5 U/mg。X3c菌株摇瓶发酵诱导3天的上清酶活为22.5 U/mL,15 min能降解6.34 Iμg/mLZEN。而同样来源G.roseum、与zhd101基因高达98%的同源性的两基因ZEN-jjm和zlhy-6在毕赤酵母中表达,发酵上清降解ZEN的酶活都相对较低。ZEN-JJM降解1μg/mL ZEN需要长达9 h,而ZLHY-6降解1.6μg/mLZEN也需要4 h。将重组酵母菌株X3c在5 L发酵罐中高密度发酵,ZHD降解ZEN的酶活最高达到150.1 U/mL,是摇瓶发酵水平的6.7倍。
[Abstract]:ZEN is used to transform ZEN into non - toxic products . ZEN - jjm and zlhy - 6 were digested with ZEN - JJM . The activity of ZEN - jjm and zlhy - 6 in ZEN was 22.5 U / mL and 6.34 I 渭g / mL ZEN .
【学位授予单位】：湖北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：1958953