Src基因在胶质瘤的表达及其对胶质瘤细胞株恶性生物学行为的影响

发布时间：2018-06-09 04:32

本文选题：酪氨酸激酶 + 胶质瘤　；参考：《第二军医大学》2016年硕士论文

【摘要】：随着医疗检查技术的不断进步,中枢神经系统胶质瘤的发现率逐年提高,近年来已不再被认为是罕见病。然而,胶质瘤的治疗手段却处于瓶颈,疗效仍然与30年前报道的数据未有明显的提高。所以,寻找新的胶质瘤治疗方法迫在眉睫。sparse representation-based classifier(Src)基因是人类最早发现的原癌基因,其蛋白产物Src是体内分布最为广泛的蛋白激酶,其通过磷酸化细胞内多种信号分子,实现参与调节细胞的增殖、分化等一系列生理活动。在结肠癌,乳腺癌和前列腺癌中,Src的表达水平与肿瘤的恶性程度呈正性相关。然而,对Src在胶质瘤中的作用仍然未有研究。本研究中,作者试图探寻Src在胶质瘤中的表达及调节机制,并明确Src对胶质瘤的肿瘤特性所起的生物学作用。首先我们发现,Src蛋白在临床胶质瘤患者手术标本中的表达较正常脑组织显著提高(P0.05),其中低级别(WHO III级)和高级别胶质瘤(WHO IIIIV级)分别较正常脑组织高出80%和190%,且高级别Src显著高于低级别胶质瘤(P0.05)。与此同时,Src的失活型蛋白表型Try530-P-Src表达水平与正常脑组织无明显差异(P0.05),但Try530-P-Src/Src比值较正常脑组织出现显著下降(P0.05)。同时,我们观察到,Src蛋白“开关”位点Try530的特异性调节蛋白CSK在低级别和高级别胶质瘤中的表达水平分别仅为正常脑组织的46%和39%(P0.01)。以上数据提示胶质瘤中,Src的表达水平和相对活性在胶质瘤中显著升高,且升高程度与胶质瘤病理分级成正比。这种病理性的Src相对活性增强主要由于胶质瘤内Src蛋白功能调节异常所致。随后,我们再依据胶质瘤患者手术标本中的Src,Try530-P-Src和CSK蛋白表达水平,对患者的预后做了评估。我们发现,Src低表达的总体生存期和疾病无进展生存期的中位时间分别为18个月和16个月,而高表达组为13和9个月,两组间均存在显著统计学差异(P0.05)。相反,Try530-P-Src低表达和高表达组的总体生存期中位时间分别为10个月和12个月(P0.05),疾病无进展生存期中位时间为5个月和11个月(P0.05)。以上数据显示胶质瘤患者的预后与Src的表达量成反比,而与Try530-P-Src成正比,提示Src高表达是预后不良指标。为了进一步明确Src对于胶质瘤的影响,我们在U-138MG胶质瘤细胞系中制作了三组不同活性的Src的细胞系,分别为CSK miRNA处理组,Src特异性抑制剂Saracatinib组,和空白对照组。比较发现,Saracatinib组细胞对于替莫唑胺的反应敏感度显著增加,IC50由对照组544.8 uM(95%可信区间:138.2 2148 uM)变为14.05 uM(95%可信区间:2.55 77.45 uM)。然而CSK miRNA的IC50却变为5,666uM(三组间P0.05)。然后,在细胞划痕实验中,Saracatinib组和CSK miRNA在第5天的侵袭速度范围较对照组出现显著降低和升高(三组间P0.05),且这个趋势在第14天同样维持。随后,我们比较细胞系的迁移能力,Saracatinib组合和CSK miRNA处理组中的迁移能力分别为298+64 cell/mm2和281+71 cell/mm2。分别显著低于和高与对照组P0.05)。最后,我们采用比较了三组间促生长相关蛋白EGFRvlll和p53的表达情况,我们发现在Saracatinib处理组中,U-138MG细胞EGFRvlll和p53相对表达量分别为对照组的76%+9.5%和138%+14%(P0.05)。相比较,在CSK miRNA处理组中,EGFRvlll和p53表达量分为对照组的150%+7.1%和65%+16%(P0.05)。以上数据提示Src可显著增加胶质瘤细胞的恶性行为。为了验证Src对于EGFRvlll和p53基因的确切性,我们采用了染色质免疫共沉淀技术对EGFRvlll和p53基因的启动组上抑制性组蛋白H3K27Me2进行了检测。我们发现当U-138MG细胞经过Saracatinib处理后,H3K27Me2在EGFRvlll基因的启动子的聚集程度显著提高,为正常时的1.2倍(P0.01)而在p53的启动子上显著下降(0.24+0.2,P0.01)。相反,当U-138MG细胞经过CSK miRNA处理后,H3K27Me2在EGFRvlll基因的启动子的聚集程度显著降低(0.77+0.11,P0.05),而在p53的启动子上显著上升(3.9+0.7,P0.05)。综上所述,Src作为经典的原癌基因,在本文中首次被报道在胶质瘤中存在表达水平,功能水平和调节水平三个层面的异常。本研究发现在胶质瘤临床标本中,Src的表达明显高于正常脑组织,且随肿瘤级别增高明显增多,表达量与患者生存期呈负相关。在U138MG细胞系中,干扰Src的表达能后抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,而且能够促进肿瘤对替莫唑胺的敏感性。表明Src可能成为胶质瘤治疗的新靶点。以上特质使得Src极有可能成为胶质瘤新的靶向治疗靶点。
[Abstract]:At the same time , the expression level and the relative activity of src in glioma were significantly higher than those in normal brain tissues ( P0.05 ) . IC50鐢卞鐓х粍544.8 uM(95%鍙俊鍖洪棿:138.2 2148 uM)鍙樹负14.05 uM(95%鍙俊鍖洪棿:2.55 77.45 uM). However , the IC50 of CSK miRNA changed to 5,666uM ( P0.05 ) . We found that the expression of EGFRvlll and p53 in the treatment group was 76 % + 9.5 % and 138 % + 16 % ( P0.05 ) . On the contrary , when the U - 138MG cells were treated with CSK miRNA , the degree of aggregation of H3K27Me2 promoter in the EGFRvlll gene was significantly decreased ( 0.77 + 0.11 , P0.05 ) , while the promoter of p53 was significantly increased ( 3.9 + 0.7 , P0.05 ) . In conclusion , as a classical proto - oncogene , the expression level , functional level and level of regulation in glioma have been reported for the first time in glioma .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4

【参考文献】