两个含有hps-phi基因表达载体的构建和功能验证以及金鱼草再生体系的建立

发布时间：2018-06-13 08:15

本文选题：甲醛 + 基因　；参考：《上海师范大学》2016年硕士论文

【摘要】：甲醛(HCHO)是装修后的主要污染物之一,对室内环境和人体健康影响较大。植物净化作为一种生态环保的净化室内空气质量的手段,一直被人们所关注。研究证明,利用基因工程手段增强转基因植物HCHO代谢能力可提高其吸收外源HCHO的速率和脱毒能力。HPS和PHI是许多甲基营养菌甲醛固定途径RuMP的关键酶。本研究论文的工作:(1)从番茄中克隆了可定位在植物叶绿体细胞器的RbcS3c基因两个长度不同启动子和信号肽序列,并进行元件分析和功能预测;(2)分析金鱼草密码子的偏好性并对目的基因hps-phi融合序列进行优化后,将RbcS3c基因信号肽和hps-phi目的基因构建到瞬时表达载体中,观察其是否定位到叶绿体中表达;(3)构建RbcS3c基因2个长度不同启动子引导hps-phi目的基因的表达载体,转化烟草获得转基因植株,通过定量PCR比较不同长度启动子启动目的基因效率,并验证hps-phi目的基因分解甲醛的作用;(4)建立金鱼草的再生体系,获得大量的可转化植株。第一部分工作结果:从番茄中克隆了可定位在植物叶绿体细胞器的RbcS3c基因两个长度不同启动子和信号肽序列,分别命名为RbcS3cPS1和RbcS3cPS2。RbcS3cPS1片段长度为738bp,对该序列进行测序分析并与已发表的RbcS3c基因(X05986)相应序列进行比较发现:在TATA盒、CAAT盒等重要功能区域并未发现有碱基的改变,说明所克隆片段即为番茄RbcS3c基因上游调控序列。Plant CARE软件分析该序列表明:该基因启动子含有多处保守序列,而且越靠近起始密码子区域序列越保守,该启动子序列除含有启动子必需的CAAT框、TATA框外,还含有G-box、I-box、box I、box II、ATC-motif等十二种与光响应有关的元件。另外,还含有一个个Me JA响应元件、一个乙烯响应元件。将该基因启动子再向上游拉长后扩增的RbcS3cPS2片段长度为1086bp序列。在从RbcS3c基因启动子738bp向上游延伸的300bp的序列中,发现这个启动子有很多与植物非生物胁迫相关的响应元件,如ABRE、G-BOX、HSE、GARE-MOTIF、TATC-BOX、MBS。与Gen Bank中X05986比对,本研究克隆的两个不同长度的RbcS3c基因启动子和信号肽序列虽然在TATA-box、CAAT-box、G-box等重要功能区域没有碱基改变,但在其他区域存在9处碱基的差异,包括8处碱基替换和1处碱基缺失,这些差异序列都存在于738bp序列中。两者与已发表的RbcS3c基因(X05986)相应序列同源性分别为98%和98.7%。这说明在不同番茄品种之间RbcS3c基因启动子序列会存在一定的差异性。第二部分工作结果:金鱼草的ENc值为61,偏大,表明金鱼草在密码子的使用上偏好性不强。叶绿体中的密码子使用较为均匀,除终止密码子外,最小的为2.5,分别是苏氨酸ACG和丝氨酸AGC,最大的是苯丙氨酸UUU,使用率在千分之53.5左右,其次是天冬酰胺千分之37.0。根据生物软件计算结果表明,GCC、GAC、GAG、TTC等30个以C或G碱基为第3位的密码子的RSCU值均大于l,且Frac值也较大,为hps-phi基因的偏好密码子。据此,将甲基营养菌中hps-phi融合基因序列根据密码子简并性优化,优化后的序列与原序列的相似度为76%左右。通过烟草瞬时表达,我们可以看到在信号肽的指导下,携带目的基因成功定位到叶绿体中。这说明我们克隆的信号肽虽然在氨基酸组成上与NCBI中报道的序列有2个氨基酸的差异,但其信号肽功能并没有发生改变,这与生物软件预测结果一致。即我们克隆的信号肽与NCBI中报道的信号肽剪切位点不同,但在功能上都可以发挥信号肽的作用。第三部分结果:分别构建两个由番茄RbcS3c基因不同长度启动子及信号肽引导融合基因hps-phi的表达载体:pC1301-RbcS3cP1S::hps-phi-Nos(小载体)和pC1301-RbcS3cP2S::hps-phi-Nos(大载体),并利用根癌农杆菌介导转化烟草获得转基因植株。利用定量PCR检测分别含有大、小载体转基因烟草植株目的基因的表达量。结果显示,在含有小载体转基因植株中,目的基因表达量平均比含有大载体转基因植株提高20多倍。转基因烟草植株抗甲醛能力检测显示,含有小载体转基因植株非常强,比野生型提高了约14-20倍,这也与目的基因定量检测结果一致。目的基因定量分析以及抗甲醛能力检测结果都表明,将启动子加长之后并没有增加外源基因的表达量,反而比没有加长的启动子表达量更低。由此我们推测,在加长的启动子序列上,可能有某些功能元件抑制了该启动子的效率,从而使目的基因的表达量下降到几乎没有表达的水平。最后,我们建立了金鱼草的再生体系,研究结果表明:IBA对金鱼草生根的促进作用明显要优于NAA,加IBA或NAA激素的培养基生根率明显高于不加IBA或NAA激素的培养基,金鱼草无根苗在附加IBA的培养基中生根效果最好,生根率100%,平均每根苗的生根数显著多于NAA所诱导的效果。其中IBA为1.5mg/L时,平均生根数达到最大值为24条左右,这与日本学者所报道的合适促进生根的浓度一致。有关本研究构建的两个载体在金鱼草中转化方法还需要进一步探索和改进。开展本研究为今后进一步培育高甲醛分解能力的金鱼草转基因植株奠定了主要的基础。
[Abstract]:In this paper , two different promoters and signal peptide sequences of RbcS3c gene were cloned from tomato . In this paper , we can see that there are some differences in the sequence of RbcS3c gene promoter . The results showed that the rooting rate of IBA was obviously better than that of NAA , IBA or NAA . The rooting rate of IBA was better than that of IBA or NAA . The rooting rate was 100 % .
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

【参考文献】