MLH1基因、miR-181b和miR-188-3p在男性无精症中的功能研究

发布时间：2018-06-19 05:16

本文选题：无精症 + MLH1　；参考：《郑州大学》2016年硕士论文

【摘要】：男性无精症的发病机理至今尚不明确,探讨精子发生机理是目前生殖领域的热点和难点。研究证实精子发生过程中减数分裂前期I发生异常,会导致减数分裂过程紊乱和停滞,甚至无精。而且无精症的发生可能与精母细胞减数分裂遗传重组中的DNA错配修复蛋白1(human mut L homologl,MLH1)有关。目前关于MLH1基因与无精症关系的研究较少,仅限于其在睾丸组织中细胞水平的表达,而关于其在无精症患者中的分子表达及其在精子发生中的功能研究,目前尚未见报道。micro RNAs(miRNAs)以其在基因调控方面发挥重要作用的特点而成为目前医学领域的研究热点。miRNAs是由20个左右核苷酸序列构成的小分子非编码RNA,通过自身的种子序列与其靶基因的3,端非编码区域(3,-UTR)进行完全或不完全配对结合,降解靶基因或抑制靶基因翻译的方式来进行基因表达的调控。目前已发现有700多种miRNAs在人体中表达,其中37种在睾丸组织的减数分裂期表达,认为miRNAs在精子发生中起重要作用。但是它们各自的靶基因是什么?通过何种途径发挥调控作用的?目前尚不清楚。miR-188是在人类和小鼠中鉴定出来的一种新的miRNA,参与多种病理生理过程。有研究显示其家族成员之一miR-188-3p在人类和小鼠的睾丸组织中表达,其靶基因可能与染色体结构相关蛋白有关,但是具体调控机制尚不清楚。通过生物信息学软件Target Scan和Micro Cosm发现,miR-188-3p与MLH1存在结合位点,提示miR-188-3p可能通过调节MLH1参与精子发生过程,但目前还无相关报道,尚需研究证实。同样miR-181b已被确认参与多个生理发育过程,关于miR-181b的研究大多集中在肿瘤方面,显示其可下调错配修复基因的表达从而保持基因组的稳定性。也有研究报道miR-181b在动物睾丸组织中高表达,但是其是否参与精子发生?MLH1基因是否与miR-188-3p和miR-181b具有调控相关性?目前国内外均尚未见报道。因此,深入研究MLH1基因在无精症患者睾丸组织中的表达特点及其与miR-188-3p和miR-181b的调控相关性,不仅为深入研究精子发生的分子调控机制提供理论依据,也将为无精症的临床治疗提供新思路。目的:本研究采用Real time-PCR和Western-Blot等多种分子生物学方法检测梗阻性无精症组、非梗阻性无精症组和对照组的睾丸组织中miR-181b、miR-188-3p和MLH1基因的表达,探讨其在各组睾丸组织中的表达特点;通过检测过表达或抑制miR-181b和miR-188-3p对精母细胞MLH1基因表达的影响,探讨miR-181b和miR-188-3p与MLH1基因的调控关系。方法:1.将收集到的各组睾丸组织取出一部分行HE染色,做成病理切片,镜下观察组织结构并拍照,比较各组睾丸曲细精管内生精细胞及精子分布特点及比例。2.分组:梗阻性无精症组、非梗阻性无精症组和对照组。不同方法检测各组睾丸组织中MLH1的基因及蛋白表达水平。Real time-PCR技术检测各组MLH1基因表达水平;采用Western-Blot技术检测各组MLH1蛋白的表达;采用免疫组化法比较各组MLH1蛋白的分布情况及积分光密度(Integrated option density,IOD)值。通过real time-PCR技术检测各组miR-181b、miR-188-3p的表达。3.分别使用miR-181b和miR-188-3p的模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor),对小鼠GC-2spd精母细胞的miR-181b和miR-188-3p进行过表达或表达抑制,分别比较过表达前后和表达抑制前后MLH1的3,-UTR萤光素酶活性和基因表达变化,探讨miR-181b和miR-188-3p过表达或表达抑制对生精细胞MLH1表达的影响。结果:1.梗阻性无精症组各级生精细胞比例及排列正常,生精细胞数目轻度减少,有少量成熟精子,精原细胞比例为13%;非梗阻性无精症组生精上皮层次减少,各级生精细胞数量严重减少且排列紊乱,无或仅有少量精子,精原细胞比例为30%;对照组曲细精管见精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和支持细胞,有较多成熟精子,精原细胞比例为15%。2.两组无精症组MLH1的基因及蛋白表达均显著高于对照组(P0.05),且非梗阻性组显著高于梗阻性组(P0.05)。3.两组无精症组miR-181b和miR-188-3p的表达显著低于对照组(P0.05),且非梗阻性组miR-181b的表达显著低于梗阻性组(P0.05)。4.过表达miR-188-3p后MLH13,-UTR萤光素酶活性和MLH1的m RNA及蛋白表达水平均低于对照组(P0.05);miR-188-3p抑制后MLH13,-UTR萤光素酶活性和MLH1的m RNA及蛋白表达水平均高于对照组(P0.05)。miR-181b过表达或者表达抑制对MLH1的m RNA及蛋白表达水平均无显著影响(P0.05)。结论:1.MLH1基因在无精症睾丸组织中高表达,miR-181b和miR-188-3p在无精症睾丸组织中低表达,可能参与精子发生过程。2.miR-188-3p与MLH1基因的调控有相关性,提示MLH1基因可能是miR-188-3p的靶基因。3.miR-181b与MLH1基因的调控无相关性。
[Abstract]:It has been found that miR - 188 - 3P plays an important role in human and mouse testis tissues , and it is not clear that miR - 188 - 3P plays an important role in human and mouse testis tissues . Results : 1 . The expression of miR - 181b and miR - 188 - 3P was significantly lower than that of control group ( P0.05 ) . The expression of miR - 181b and miR - 188 - 3P in non - obstructive group was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2

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