丹参转录因子基因SmPAP1的转录自激活及其调控丹参次生代谢途径的研究

发布时间：2021-03-09 06:12

丹参(Salvia miltiorrhize Bunge)是唇形科鼠尾草属多年生药用植物,具有活血通心、祛癖生新、凉血解痈等多种功效,临床上广泛用于多种疾病的预防与治疗。丹参水溶性酚酸类物质作为其主要的药用成分,越来越受到研究者的关注。我们前期研究发现,丹参R2R3-MYB类转录因子SmPAP1够作为一个重要的调控蛋白参与调控酚酸类物质的生物合成。目前关于SmPAP1的研究主要集中在其对下游靶基因的转录调控模式,但是作为一个重要的调控蛋白,有关其自身基因转录调控机制的研究还未见报道,亟待补充。对SmPAP1启动子区保守DNA序列元件的分析结果显示,在其启动子的不同区域内存在多个潜在结合植物MYB类转录因子的顺式作用元件,推测在丹参中SmPAP1可能作为一个正向调控蛋白结合于自身基因启动子从而激活自身基因表达。鉴于此,本研究采用由SmPAP1基因启动子驱动GUS基因的报告载体,利用瞬时表达报告基因检测法和叶盘转化法分别在体外及体内探究SmPAP1是否能够激活其自身基因启动子的转录活性。同时,为进一步分析转录因子SmPAP1在丹参次生代谢途径中的潜在调控作用及分子作用机制,对丹参野生型及SmPAP1过表达植株进行转录组测序及分析,探究在丹参中由SmPAP1过表达导致的差异表达基因可能行使的生物学功能及参与调控的生物学过程。本研究结果如下：1.利用根癌农杆菌介导的瞬时表达技术,将效应载体35S::SmPAP1和报告载体SmPAP1-promoter::GUS在烟草表皮细胞中进行共表达,通过检测报告基因的表达水平间接分析SmPAP1的过表达是否能够激活其自身启动子的转录活性。GUS组织化学染色和GUS蛋白活性检测结果表明,SmPAP1的过表达能够提高烟草细胞中GUS基因表达量及GUS蛋白活性,并且与对照组相比,其活性提高了5.15～15.50倍。说明SmPAP1转录因子具有在胞内对自身启动子进行激活的能力。2.利用叶盘转化法将表达载体SmPAP1-Promoter::GUS分别转化到SmPAP1过表达、SmPAP1沉默及野生型丹参植株中,分析在丹参中SmPAP1表达量不同的情况下其自身启动子的转录活性变化。经PCR检测,分别获得9个过表达阳性株系(OE),16个沉默阳性株系(ir)和7个野生型阳性株系(C.K.)。实时定量PCR结果显示：与对照组(C.K.)相比,过表达阳性株系中GUS基因表达水平均表现出不同程度的升高,而沉默阳性株系中GUS基因表达水平则显著降低。GUS染色及GUS蛋白活性检测结果表明,GUS基因表达量及GUS蛋白活性均与丹参中SmPAP1基因的表达量呈明显正相关：当SmPAP1表达量升高时,GUS染色加深且蛋白活性显著升高,为对照组(C.K.)的1.43～2.13倍；相反当SmPAP1表达量降低时,GUS染色变浅且蛋白活性极显著降低,为对照组的1.30%-2.99%。说明在丹参中SmPAP1能够直接或间接地激活其自身启动子的转录活性。3.为进一步明确转录因子SmPAP1对丹参次生代谢途径的潜在调控作用,对丹参野生型及SmPAP1过表达株系进行基于转录组测序的差异基因筛选。结果显示,与野生型植株相比,共有1,559条基因表达量发生显著变化,其中566条基因表达量上调,993条基因表达量下调。Gene Ontology功能显著性富集分析结果显示,差异基因共参与了69个GO ter m,即25个生物过程、38个分子功能以及6个细胞组成,较为显著的GO分类有催化活性、响应外界胁迫等。KEGG Pathway分析结果显示,差异基因共参与了75条代谢途径,显著富集的途径为9条,包括苯丙烷生物合成途径、类黄酮生物合成途径、二萜类生物合成途径等。其中,次生代谢产物生物合成途径中富集的差异基因数目最多,显著性也最强。说明,在丹参中过表达SmPAP1后,主要影响丹参次生代谢途径。对差异基因进一步分析结果表明,转录因子SmPAP1可能通过激活酪氨酸代谢途径中TAT和苯丙烷代谢途径中PAL基因的表达,促进酚酸类物质的合成积累；同时,SmPAP1基因的过量表达还降低了丹参酮类物质合成途径中关键酶基因CPS的转录水平。本研究通过体外及体内实验探究了转录因子SmPAP1对其自身启动子的转录激活作用。实验结果初步证明了在丹参中存在5SmPAP1基因的转录自激活调控。另外,SmPAP1基因参与了多条次生代谢途径的调控,可能是通过调控PAL和TAT的表达影响丹酚酸类物质合成。本研究为阐明SmPAP1转录因子的分子功能及调控机制提供一定的资料。
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S567.53

文章目录

摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 MYB类转录因子的概述

1.1.1 MYB类转录因子的结构与分类

1.1.2 R2R3-MYB类转录因子对植物的次生代谢的调控

1.2 丹参研究概况

1.2.1 丹参概况

1.2.2 丹参的主要活性成分及药理作用

1.2.3 丹参酚酸类物质生物合成途径的研究概况

1.2.4 转录因子PAP1调控丹参酚酸类物质生物合成途径的调控

1.3 DNA与蛋白质相互作用的研究

1.3.1 DNA与蛋白质相互作用的研究方法

1.3.2 基于瞬时表达系统的DNA与蛋白质相互作用的研究

1.4 转录组测序

1.4.1 转录组的概念

1.4.2 测序技术的发展

1.4.3 药用植物转录组研究的意义

1.5 本研究的目的及意义

第2章烟草中转录因子基因SmPAP1的转录自激活研究

2.1 实验材料、试剂及主要仪器

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株及载体

2.1.3 试剂与药品

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 表达载体导入根癌农杆菌GV3101

2.2.2 农杆菌介导的烟草瞬时表达

2.2.3 GUS组织化学染色

2.2.4 GUS蛋白活性检测

2.3 实验结果与分析

2.3.1 烟草GUS组织化学染色结果

2.3.2 烟草GUS蛋白活性检测结果

2.4 讨论

第3章丹参中转录因子基因SmPAP1的转录自激活研究

3.1 实验材料、试剂及主要仪器

3.1.1 植物材料

3.1.2 菌株

3.1.3 试剂与药品

3.1.4 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 表达载体导入根癌农杆菌EHA105

3.2.2 PCR鉴定根癌农杆菌EHA105转化子

3.2.3 根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参

3.2.4 转基因丹参株系的DNA水平检测

3.2.5 转基因丹参株系的RNA水平检测

3.2.6 转基因丹参株系的GUS组织化学染色

3.2.7 转基因丹参株系的GUS蛋白活性检测

3.3 实验结果与分析

3.3.1 转基因丹参株系DNA水平的检测

3.3.2 转基因丹参株系的GUS基因表达水平检测

3.3.3 转基因丹参株系GUS组织化学染色结果

3.3.4 转基因丹参中GUS蛋白活性的定量检测

3.4 讨论

第4章基于转录组测序的差异表达基因分析

4.1 植物材料

4.2 实验方法

4.2.1 总RNA的提取

4.2.2 RNA测序

4.2.3 数据分析

4.2.4 转录组的差异表达分析

4.2.5 差异基因的富集分析

4.2.6 丹参SmPAP1过表达植株中次生代谢相关基因的差异表达分析

4.2.7 差异基因的实时定量PCR验证

4.3 实验结果与分析

4.3.1 测序产量统计

4.3.2 差异表达基因的筛选

4.3.3 Gene Ontology功能显著性富集分析

4.3.4 KEGG Pathway显著性富集分析

4.3.5 丹参次生代谢相关的差异表达基因

4.3.6 部分差异基因的实时定量PCR验证

4.4 讨论

第5章结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间研究成果

【参考文献】