卵巢癌预后相关新基因的鉴定及其功能研究

发布时间：2018-09-05 18:34

【摘要】：目的:卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)是妇科常见的恶性肿瘤,在女性生殖器官恶性肿瘤中,卵巢癌的发病率占第三位,但由于早期诊断困难和化疗耐药,且易发生腹腔转移,卵巢癌的死亡率居第一位,其五年生存率仅为30%左右,故卵巢癌又被称为“沉默杀手”。对于卵巢癌有效的早期筛查或治疗都应基于对疾病发病机制的详细了解,而以往卵巢癌的病因学研究多集中在环境、行为、生殖等方面,随着分子生物学技术的发展,近年来更多的研究体现在癌基因和抑癌基因方面,研究者发现,卵巢癌的发生、发展与多种基因的突变、失活、表达异常有关,研究相关基因水平改变,寻找新的卵巢癌相关致病基因,对探讨卵巢癌发生发展机制将起重要的作用,将为卵巢癌的早期诊断,治疗手段的选择,治疗药物的应用以及新药研发提供积极的帮助。美国癌症基因组图谱计划TCGA(The Cancer Genome Atlas)是近年来启动的肿瘤基因组数据库,这些大数据的出现,为肿瘤分子靶点的发现提供了机遇,对于研究者全面系统了解恶性肿瘤的形成、生长、转移等过程的生物学基础,以及与病理机制相关的基因组变化,促进癌症的早期诊断和加速癌症治疗的发展步伐起到重要推动作用。本研究拟先通过生物信息学的方法从高通量基因组数据库中筛选出一批与卵巢癌患者预后密切相关的基因,结合文献检索创新性确定待研究候选基因,锁定候选基因后运用体外实验分析以上基因对肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭等的影响,并进一步探讨候选基因在卵巢癌中发挥作用的相关信号通路,同时评价以上基因作为诊断、预后判断指标的可行性。方法与结果:第一部分:卵巢癌差异表达基因的筛选。采用网络共享数据库TCGA数据,通过生物学信息学分析卵巢癌差异表达基因,从TCGA数据库中下载卵巢浆液性囊腺癌的m RNA表达谱芯片数据,芯片平台是Agilent G4502A。原始数据预处理之后,总共得到17814个基因的表达数据,通过R中Limma软件包和T-test进行差异表达基因分析,两种方法共有差异表达基因数目为2010个,分别使用DAVID对差异基因进行GO和KEGG pathway富集分析,设定p0.05作为筛选的条件,功能注释结果显示,卵巢癌差异表达基因富集在细胞粘附、细胞凋亡等功能以及主要参与粘着斑、癌症相关等信号通路中。2.卵巢癌预后相关新基因的鉴定和确认。对TCGA数据库中卵巢癌的临床数据进行筛选,保留的样本数量共580例。并运用单因素Cox回归方法筛选,得出32个基因对卵巢癌患者的预后影响有显著意义(p0.01)。采用随机分组的方法把包含完整2年随访数据的样本分为训练组和验证组,两组的样本数目分别为214例和212例。分别使用上述划分的训练集和验证集进行生存分析,对于每一个基因,根据其表达值对样本进行分类,并结合临床数据,使用单因素Cox回归分析,log-rank检验进行预后分析并绘制KM预后曲线图。根据生存曲线筛选结果,结合文献查新和应用前景分析,最后选取与预后密切相关的3个基因(CD27、SPINK13和RHPN2)进行研究。其中CD27、SPINK13的低表达与较断的患者生存率相关,而RHPN2的高表达则提示患者预后不良。第二部分:1.CD27对卵巢癌细胞的抑制作用及机制研究。前期的实验结果表明CD27的低表达与患者的较短生存期相关,提示CD27具有抑癌基因样功能。为了研究CD27的功能,我们以卵巢癌细胞系和组织样本为研究对象,通过检测其表达情况,以及过表达和下调CD27的方法研究其在卵巢癌中的作用。实验先通过细胞转染CD27过表达质粒上调其在SKOV3和A2780细胞中的表达水平。转染成功后,采用MTT法检测细胞增殖活力,采用AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡率。结果提示CD27可以显著抑制卵巢癌细胞的增殖活力,同时提高细胞凋亡率。而后,我们又通过抑制CD27相关信号通路的方法来研究其功能,结果发现下调CD27可以促进细胞增殖同时降低细胞凋亡率。以上结果证明了CD27具有抑制增殖促进凋亡的功能。接下来对CD27可能的下游分子机制进行了初步研究,发现CD27能够显著抑制IL-6的水平,同时IL-6可以显著促进卵巢癌细胞增殖并可以完全逆转CD27的抑制增殖和促进凋亡的效应。这些结果提示CD27对卵巢癌的作用可能与其对IL-6的抑制有关。2.SPINK13对卵巢癌细胞的抑制作用及机制研究。本部分的实验中,我们同样先验证SPINK13在上皮性卵巢癌组织样本及细胞系中的表达情况,后分别使用过表达和下调SPINK13水平的方法对其功能进行研究。首先,我们采用SPINK13过表达真核质粒,通过细胞转染上调其在卵巢癌细胞系中的表达水平。结果发现,上调SPINK13能够明显抑制细胞增殖活力同时促进细胞凋亡。反之,下调SPINK13的水平能够显著促进细胞增殖以及降低细胞凋亡率。同时,实验检测了EMT相关分子标记,以及SPINK13对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。结果发现,SPINK13能够抑制EMT过程,抑制细胞的迁移功能。而后,在对其分子机制的研究中我们又发现,SPINK13能够显著抑制u PA的表达。而重组u PA可以逆转SPINK13对细胞迁移和侵袭的抑制作用。鉴于这些实验结果,提示SPINK13可能通过靶向u PA,进而抑制EMT的机制发挥其调控卵巢癌细胞增殖、凋亡和迁移作用。3.RHPN2对卵巢癌细胞的作用研究。在对RHPN2功能的研究中我们发现,通过构建的RHPN2的si RNA可以下调RHPN2,并抑制细胞增殖活力同时提高细胞凋亡率,但上调RHPN2水平,却对过表达细胞的增殖活性并没有明显作用。于是,在对RHPN2过表达质粒重新测序的过程中,我们发现其发生了位点突变,突变位点为G46A,因此我们认为,可能由于该点突变导致蛋白功能的缺失,对其功能的研究还需进一步深入。结论:本研究采用生物学信息学统计方法从高通量的TCGA数据库中筛选卵巢癌差异表达基因,并结合生存期进行预后分析验证,并经文献查新和应用前景筛选,最后锁定3个新的与卵巢癌预后密切相关的基因(CD27、SPINK13和RHPN2),其中CD27、SPINK13的低表达与较短的患者生存率相关,而RHPN2的高表达则提示患者不良预后相关,本课题组进一步通过体外实验方法验证以上三种基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭等恶性生物学行为的影响,初步研究论证了CD27抑制卵巢癌的功能可能与其显著抑制IL-6有关;而SPINK13抑制卵巢癌细胞的作用的靶点之一可能是u PA,并与EMT进程相关。本研究有利于进一步丰富卵巢癌发生发展等恶性生物学行为的形成机制理论,新的卵巢癌预后相关基因有望为卵巢癌患者的预后判断提供新的分子标志物,为卵巢癌的治疗提供新的值得深入研究的潜在治疗靶点。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

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