【摘要】：近年来大量研究表明,表观遗传修饰异常不但影响神经元的发育及突触可塑性,而且和多种认知障碍性神经精神疾病密切相关。表观遗传修饰包括DNA甲基化及去甲基化、组蛋白乙酰化、非编码micro RNA干扰等多种不涉及DNA序列改变而对基因功能进行的可逆可遗传性调节过程。DNA甲基化(DNA Methylation)是表观遗传修饰的一种重要形式,通过游离甲基与双链DNA序列上Cp G岛的胞嘧啶碱基C5碳原子的共价结合来实现。DNA甲基化过程由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,Dnmts)催化完成。真核生物中枢神经系统内的DNA甲基化酶主要包括Dnmt1,Dnmt3a以及Dnmt3b三种。虽然Dnmt3b在成熟神经元内的表达水平明显下降,但其对突触可塑性和记忆形成仍有重要的调节作用。已有研究证据表明Dnmt3b参与学习记忆的相关过程,但其内在分子生物学机制尚未阐明。因此,为了更加深入的探讨Dnmt3b基因在成熟神经系统学习记忆过程中的作用及机制,我们用AAV-Cre-GFP病毒定位注射的方法条件性敲除Dnmt3b基因在小鼠海马CA1区的表达,同时用αCa MKII-Cre工具鼠建立αCa MKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox条件性兴奋性神经元基因敲除小鼠,应用高架十字迷宫、旷场实验、新物体识别、新位置识别、Morris水迷宫等行为学范式对两种条件性敲除小鼠学习记忆能力进行测试。并应用原代细胞培养、钙离子成像、基因表达谱芯片等技术从细胞水平及分子水平进一步探讨其内在机制。结果如下:1.慢病毒注射方法在成年小鼠海马CA1区敲除Dnmt3b基因后,小鼠自发活动、探索能力均未受到影响,且不存在焦虑等情绪障碍。2.成年小鼠海马CA1区条件性Dnmt3b基因敲除影响小鼠的位置识别记忆。3.αCaMKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox基因敲除小鼠的自发活动及焦虑状态无异常。4.αCa MKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox基因敲除小鼠表现出位置识别记忆障碍。5.慢病毒敲除Dnmt3b基因不影响原代培养的海马神经元(DIV 21天)树突形态及兴奋性突触形成。6.慢病毒敲除Dnmt3b基因增加原代培养的海马神经元(DIV 21天)谷氨酸(50μM)诱导的胞体内钙浓度增加。7.用基因表达芯片技术分别对AAV病毒注射小鼠以及αCaMKII-Cre条件性基因敲除小鼠海马CA1区的差异表达基因进行了筛选,筛选出的差异表达基因用real-time q RT-PCR进行验证,结果显示,α-2,6唾液酸糖基转移酶(betagalactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 2,St6gal2)在病毒注射小鼠以及αCa MKII-Cre条件敲除小鼠海马CA1区的表达均上调,差异达2.5倍以上,且有统计学意义。8.条件性敲除小鼠海马神经元中的Dnmt3b基因引起小鼠海马区Dnmt1及Dnmt3a的表达量代偿性增高。而新物体识别(NPR)训练1h后条件性敲除小鼠海马区Dnmt1基因表达显著下降。综上所述,在病毒介导的局部脑区基因敲除和遗传性条件性基因敲除两种模型小鼠上,我们研究发现,条件性敲除小鼠海马区神经元中Dnmt3b基因可导致小鼠海马依赖的物体位置识别记忆障碍。Dnmt3b基因敲除不影响海马神经元的树突形态及兴奋性突触形成,但是可明显促进谷氨酸诱导的胞内钙离子浓度的增加,提示Dnmt3b基因敲除显著增加海马神经元的活动。根据基因芯片筛选并验证的结果,我们推测Dnmt3b基因敲除上调了唾液酸糖基转移酶的表达,并通过改变神经元内糖蛋白及糖脂的唾液酸酸化作用造成海马神经元的过度激活及钙超载,从而影响了海马神经环路突触的传递及(或)可塑性,并影响了小鼠的物体位置识别记忆过程,内在的细胞及突触传递等具体机制还有待进一步研究。为验证这一假说,我们正在进行的实验包括:(1)用western blot的方法分析DNMTs,St6gal2和它的反应底物PSA-NCAM蛋白在海马的表达。(2)在脑片上用电生理方法记录海马突触传递及可塑性变化。(3)考察海马CA1区注射St6gal2抗体或病毒介导特异性sh RNA表达,以拮抗St6gal2表达上调,是否能反转dnmt3b敲除引起的物体位置识别记忆障碍。值得注意的是,我们还发现,正常小鼠新物体识别(NPR)实验训练后海马区Dnmt1基因的表达显著下降,提示Dnmt1基因表达的可塑性下调可能与小鼠NPR记忆的形成相关。Dnmt3b基因敲除引起的Dnmt1和Dnmt3a的表达代偿性增加,可能阻碍了这种活动依赖性的Dnmt1可塑性下调,从而参与了位置识别记忆障碍的形成。因此,我们认为直接分子机制(St6gal2表达上调)和间接分子机制(Dnmt1代偿性上调)可能共同参与了海马Dnmt3b基因敲除所致的新物体识别记忆障碍形成,具体机制有待进一步深入研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749
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