【摘要】：目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生于老年期或者老年前期的中枢神经系统退行性病变,主要特征表现为进行性认知功能损害和行为障碍,属于老龄人群最常见的痴呆类型,约占老年期痴呆的50%~70%。临床一般将AD以65岁为界限,分为早发型AD(early-onset AD,EOAD)和晚发型AD(Late-onset AD,LOAD)。无论EOAD还是LOAD都被证实与遗传密切相关,其中EOAD多表现为常染色体显性遗传,而LOAD的遗传模式较为复杂,可能是遗传、环境和代谢共同作用的结果,其中APOE基因是最为公认的LOAD易患基因,APOEε4基因携带者是散发性AD的高危人群。细胞生物学以及流行病学研究发现脂质代谢改变在LOAD患者中普遍存在,但目前缺乏对于脂质代谢与LOAD相关性的基因调控方面的研究。研究业已证实APOE基因突变仅与不到50%的易感个体发病相关,提示AD其他的遗传学危险因素未被发现。表观遗传学信息主要负责执行DNA遗传信息的指令的时机和方式,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA比如miRNA的调控3个方面。遗传和表观遗传改变可能影响脑组织miRNA表达,失调的Micro RNAs(miRNAs)与β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的产生、Tau蛋白的病理性沉积、突触可塑性、炎性反应等有关。同时表观遗传学的信息改变是可以逆转的,从而为治疗提供了新的途径。miRNAs发挥转录后下调作用,它们对靶基因的3’非编码区(UTR)的靶序列可能因单核苷酸基因多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)而改变。miRNAs参与脂质相关基因的表达调控,包括凝聚素基因(Clusterin gene,CLU)、脂蛋白脂酶基因(Lipoprotein lipase gene,LPL)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白6基因(LDL receptor related protein6 gene,LRP6)。这些基因的miRNAs结合区域的基因多态性可能通过miRNAs调控的途径介导AD的发病。CLU又称载脂蛋白J(apolipoprotein J,Apo J),是AD的第3风险基因,位于染色体8p21-p12区域,即AD的兴趣区域,参与LOAD 9%的发病风险。LPL属于甘油三酯(triglyceride,TG)代谢的关键酶,LPL基因位于人类染色体8p22,LPL基因的SNPs与AD的病理过程显著相关,LPL可与APOE及其受体LRP相互作用,而APOE和LRP都有增加AD风险的基因多态性。LPL可以与AD相关蛋白Aβ直接相互作用,从而促进星形胶质细胞通过葡糖胺葡聚糖依赖的Aβ的内吞。LPL正常功能受到影响后,可能会导致Aβ清除障碍,最终加剧AD的发生和进展。LRP和淀粉样前体蛋白、配体APOE等共存于AD的病理特征之一即老年斑中,并调节着淀粉样前体蛋白和载脂蛋白E的代谢。人类LRP6基因定位于染色体12p11.2-p13.3,之前的研究提示,LRP6δ3 m RNA在AD脑中与对照组相比水平明显扩增,所以LRP6的SNPs基因多态性与AD相关。为此根据Target Scan、miR-base数据库筛选,我们探讨如下6个基因的miRNA结合位点与LOAD发病风险的关联性,包括:CLU(miRNA-382结合位点rs9331949)、LPL(miRNA-424/-146b-5p/-15a/16/497结合位点rs1059507;miRNA-135a/-96/-514结合位点rs3200218;miRNA-143/-511/-140-5p结合位点rs3208305;miRNA-210结合位点rs3735964)以及LRP6(miRNA-601结合位点rs2160525)6个基因的3’UTR SNPs。我们通过基因表达调控层面寻找AD的易患基因,期待为AD的诊治提供新的理论依据。方法采用病例对照研究,从2011年1月到2015年12月,本课题组连续在青岛市立医院,青岛大学附属医院,青岛市海慈医院和市内四区的其它医院,以及周边的几所市级医院收集AD病例,同期在上述医院的健康查体中心收集健康对照,包括2338例独立观察对象:其中LOAD患者984例,健康对照1354例。所有纳入对象均出生于山东省,常年居住于山东地区。所有纳入病例和对照的研究对象的年龄均大于65岁且互相之间无血缘关系。病例组和对照组年龄、性别均匹配。所有入选病例均获得了其本人或其监护人的知情同意。研究对象或其监护人均签署知情同意书,而且本研究由青岛市市立医院伦理委员会通过。所有研究对象根据1984年美国国立神经病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病学会(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer’s disease and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)对于“很可能的AD”的定义对患者进行诊断,其中我们对受试者进行简易的精神状态量表和日常行为功能量表测试;健康对照组认知功能及日常生活能力正常,自身与以往相比无明显下降且与常人无明显差别;所有研究对象年龄大于65岁,并且排除有严重影响神经系统功能的内科疾病患者。采集清晨空腹时肘正中静脉血,采用Wizard染色体DNA提纯试剂盒通过静脉全血提取染色体DNA。我们进行了rs9331949、rs1059507、rs3200218、rs3208305、rs3735964以及rs2160525位点的3’UTR SNPs及APOE基因分型检测。rs3208305,rs2160525,rs1059507和rs9331949位点的SNP基因型检测原理是双连接和多重荧光聚合酶链反应。rs3735964和rs3200218多态性检测原理是聚合酶链反应-连接酶检测反应。APOE基因型的检测根据Donohoe等所叙述的方法,我们通过对其扩增产物长度的判断,把Apo E三种常见的等位基因ε2,ε3,ε4携带情况分为E2/2,E2/3,E2/4,E3/3,E3/4及E4/4等6种基因型。计算病例组和对照组基因型的Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)拟合优度。AD病例组和对照组分为APOEε4阳性和阴性亚组,采用χ2检验计算其基因型和等位基因分布差异,包括P值,比值比(Odds Ratio,ORs),95%置信区间(confidence intervals,CIs)。校正性别、APOEε4情况和发病年龄或检查年龄后,通过多变量Logistic回归分析计算OR值和95%CIs,以评估如下3个模型的基因型和等位基因与AD的关联性,赋值情况:显性模型为1(aa+Aa)和0(AA),隐性模型为1(aa)和0(Aa+AA),叠加模型为0(AA)和1(Aa)和2(aa)(A代表主要等位基因,a代表次要最小等位基因)。针对基因优化模型的SNP-APOE的交互作用进行了计算。数据分析采用SPSS19.0分析软件,P0.05认为有统计学意义。最后进行连锁不平衡和单体型分析,验证LPL的4个位点是否与LOAD风险有关联。结果纳入的研究对象中,LOAD患者984例,年龄和性别相匹配的健康对照者1354例,年龄(P=0.186)和性别(P=0.068)在病例组和对照组差别无统计学意义(LOAD组的发病年龄与对照组的检查时年龄相比较)。病例组的MMSE评分显著低于对照组(P0.001)。APOEε4等位基因情况在LOAD组和对照组中差别有显著统计学意义(P0.001);APOEε4基因在亚组中增加2.44倍LOAD患病风险(OR=2.44;95%CI::1.98~3.00;P0.001)。HWE检验证实,除rs3208305以外,研究中的检测SNPs符合H-W平衡。重新检查基因分型未发现错误,推测这种不平衡可能是由于样本规模、人群地域分配、随机遗传漂变等其他不确定的因素造成的。基于对照组所检测到的最小等位基因频率,我们研究的样本量在0.05的差异性水平上具有超过80%的统计学功效来检测比值比(odds ratio,OR),这提示本研究对象具有很好的中国汉族人群的代表性。在总体的样本中,我们仅观察到rs9331949(P0.001,Pc=0.001)和rs3735964(P=0.006,Pc=0.036)在病例组和对照组的基因分布中差异有显著性。在调整了年龄、性别和APOEε4等位基因情况后,rs9331949与LOAD的相关性仍然存在。与此同时,rs9331949等位基因C的出现增加1.3倍的AD患病风险(P0.001,OR=1.30,95%CI=1.14~1.50)。根据APOEε4情况进行携带者和非携带者的分组,在总样本中,我们发现rs3200218和APOEε4的交互作用。对于rs9331949,基因型和等位基因频率在LOAD组和对照组中APOEε4携带者和非携带者中存在显著性差异,最小等位基因(等位基因C)者显著增加了LOAD风险。进行Bonferroni调整后,基因型和等位基因频率仅在APOEε4非携带者中有显著性差异。对于rs3200218,APOEε4携带者中,LOAD组和对照组有显著性差异,最小等位基因(等位基因G)明显增加了LOAD风险。然而,这种显著性的差异在Bonferroni调整后消失;其他四种SNPs的基因型和等位基因频率与AD的患病风险无明显相关。进行了多元Logistic回归分析以评估6种SNPs在总样本、APOEε4携带者和非携带者LOAD的作用(在总体样本中调整性别、发病或检查年龄和APOEε4携带情况,对APOEε4携带者和非携带者仅做性别和年龄的调整)。对于rs9331949,进行Bonferroni调整后,叠加模型和隐性模型显示与LOAD相关。但在APOEε4非携带者中,仅有隐性模型在Bonferroni调整后显示与LOAD相关(OR=2.09,95%CI=1.45~3.02,Pc=0.02).其他5个SNPs在Bonferroni调整后,在上述三个遗传学模型中在总样本、APOEε4携带者和非携带者与LOAD风险关系不明确。连锁不平衡和单体型分析提示,4种SNPs(rs1059507,rs3200218,rs3208305和rs3735964)在所有3个数据集中形成1个单体型(总样本:D’=1.0,r2=0.01)。3种SNPs(rs1059507,rs3208305和rs3735964)在APOEε4携带者中形成1个单体型(APOEε4等位基因携带者:D’=1.0,r2=0.011)。4种SNPs(rs1059507,rs3200218,rs3208305和rs3735964)在APOEε4非携带者中形成1个单体型(APOEε4等位基因非携带者:D’=1.0,r2=0.376)。进一步,在总样本、APOEε4非携带者中,我们发现4个SNPs形成4个单体型(TCCA,TCCG,ATCA,ACAA),但是他们在任何数据集中与LOAD风险都无明显相关(P0.05)。此外,3个单体型(TCC,ATC,ACA)在APOEε4携带者中有3种SNPs形成(P0.05)。连锁不平衡和单体型分析提示LPL4个位点与LOAD风险无明显相关。结论:1、APOEε4基因携带者能够增加2.44倍LOAD患病风险。2、CLU 3’UTR miRNA结合区的rs9331949位点基因多态性与LOAD相关,rs9331949等位基因C的出现增加1.3倍的AD患病风险。3、在APOEε4等位基因非携带者亚组中,rs9331949基因多态性仍与LOAD显著相关。4、LPL(rs1059507、rs3200218、rs3208305、rs3735964)以及LRP6(rs2160525)3’UTR miRNA结合区基因多态性未发现与LOAD相关。我们的研究为揭示脂质代谢相关基因导致阿尔茨海默病的发病机制和生物标志物提供初步理论证据;为表观遗传学在AD的诊治研究构建理论基础。该3’UTR SNPs针对LOAD发病风险的作用机制有待于未来更多的研究,同时也为全面了解AD的发病和进展以及AD的治疗提供了更多途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
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