松嫩盐单胞菌中Group 1型Mrp系统的基因克

发布时间：2018-10-14 18:21

【摘要】：松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T是一株可在15%的Na Cl及pH 10.0的碱性环境下生长的中度嗜盐菌(Moderately halophile)。本研究首先以构建基因文库的方法为基础结合基因功能互补法,利用大肠杆菌(Escherichia coli)Na~+/H~+逆向转运蛋白基因缺陷型株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),从松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T中筛选到1个Group 1 mrp操纵子,它是一个编码多亚基单价阳离子/氢逆向转运蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter),并将其定名为Hs_mrp,其编码蛋白命名为Hs_Mrp。Hs_mrp操纵子全长6 Kb,包含6个完整的开放式阅读框和一个截短的ORF融合进Lac Z的阅读框(与同源蛋白只缺少1个氨基酸)(ORF7-13),并且它们拥有一个共同的启动子。通过蛋白同源比对发现,Hs_Mrp与湛江盐单胞菌(H.zhanjiangensis)中推测的单价阳离子/氢逆向转运蛋白Hzj_Mrp的七个亚基具有最高同源性(88.7%-98.9%)。与已鉴定的Group 1 Mrp比对,发现除了与来自H.zhaodongensis的Hz_Mrp同源性较高(83.5-97%)以外,与其他已鉴定的Mrp对应亚基均表现出较低同源性(最高为48.1%,最低28.9%)。同时,基于比对结果构建其系统进化发育树,结果显示Hs_Mrp与一个已鉴定的和几个推测的Group 1型Mrp聚在一起且形成一个独立分支,这说明Hs_mrp的确编码一个Group 1型Mrp系统。为了深入地揭示Hs_mrp的耐盐碱机制,我们分别在异源宿主大肠杆菌(E.coli)KNabc和在同源宿主NEAU-ST10-39~T Hs_mrp基因敲除突变菌株中进行了相关功能鉴定实验。结果如下:(1)在异源宿主中,耐盐碱测定显示:Hs_mrp可使(E.coli)KNabc在0.8 M Na Cl、一定浓度Li Cl(5 m M)及p H 8.0的碱性环境中恢复生长;阳离子/H~+逆向蛋白活性测定显示,KNabc/p UC-mrp制备的反转膜在p H 7.5-9.5的范围内表现出了较高的Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运活性,且在p H 9.5下活性最高,表观K0.5值分析显示,Na~+、Li~+和K~+的K0.5值分别是0.64、1.05和0.76。结果说明Hs_Mrp是pH依赖性的Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运蛋白且即Na~+是最适底物,其次是K~+和Li~+。(2)首先成功构建了基因敲除质粒pK18-mrp-Nco I和携带庆大霉素抗性的pK18-mrpGm;其次,敲除质粒p K18-mrp-Nco I通过电转化方法顺利进入NEAU-ST10-39~T;然后利用反向筛选成功地获得了两株Hs_mrp基因敲除菌株,我们将其命名为NEAU-ST10-39~T-?mrp-7和NEAU-ST10-39~T-?mrp-23;最后,我们成功将携带有完整Hs_mrp操纵子的重组穿梭质粒p MCS5-mrp转入到敲除突变株中,将其互补突变菌株命名为NEAU-ST10-39~T-?mrp/p MCS5-mrp。(3)在同源宿主中,对Hs_mrp敲除突变株进行了相应生理测试。耐盐测试结果发现:NEAU-ST10-39~T-?mrp/pMCS5-mrp(互补突变株)表现出与野生型菌株类似的耐盐能力,既Hs_mrp操纵子可以互补敲除菌株;处于pH 7的中性条件下,存在2%和3%的NaCl浓度时,敲除菌株与野生型菌株和互补突变株的生长情况没有差异;然而,随着盐浓度的升高,敲除菌株的生长明显受到抑制。在pH8或pH9的碱性条件下,从2%或3%的NaCl浓度开始,敲除菌株生长就已经受到了明显的抑制。以上表明:在中性条件下,Hs_mrp对宿主菌在高盐下的生长具有重要作用;而在碱性条件下,Hs_mrp对宿主菌在较低盐浓度下的生长就已经起到作用。鉴于以上结果,我们认为Hs_Mrp是一个具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运活性的Group 1型Mrp系统;并成功地构建了NEAU-ST10-39~T的Hs_mrp基因敲除突变菌株。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【参考文献】