葡萄MybA1基因的克隆、序列分析及其表达规律的研究

发布时间：2021-03-25 09:34

  MybA1是调控合成花色苷重要酶UFGT的重要因子。本文以酿酒葡萄赤霞珠为试材。首先采用PCR技术获得MybA1基因全长序列,构建克隆载体和表达载体获得重组质粒pET-mybA1, IPTG诱导表达后经Ni-NTA亲和纯化得到高纯度重组蛋白,并以此为抗原免疫新西兰大白兔,获得了高效价、高特异性的MYBA1多克隆抗体。其次,采用western blot分析MYBA1蛋白在赤霞珠果实花后各时期以及各组织部位的表达规律,荧光定量技术分析VvmybA1基因在赤霞珠果实花后各时期以及各组织部位的瞬时表达规律,并将MybA1与LAR1、LAR2、DFR、ANS、ANR和UFGT的表达以及各基因与花色苷积累进行了相关性分析,得到的结果如下：(1)克隆获得了751bp、具有完整编码框的MybA1基因片段,其编码的一个由250个氨基酸组成、分子量约为28kDa的多肽。成功构建了重组表达载体pET-mybA1。(2)通过对MybA1的基因进行生物学分析得出：MYBA1蛋白为亲水性,定位于膜外,属于SANT超基因家族；二级结构由α螺旋、无规则卷曲、少部分延伸链以及很少的β转角结构构成;三级结构显示该蛋白为典型的R2R3-MYB蛋白；在所有含MybAl基因的几种物种中只有变叶葡萄与葡萄的同源性较高,其它非葡萄科物种与葡萄的同源性均较低。(3) IPTG农度为0.6mmol/L、37℃条件下诱导5h的条件下获得高表达的重组蛋白,经Ni-NTA亲和纯化获得高纯度的MYBA1融合表达蛋白。以His-mybA1为抗原成功获得具有高效价(1：512,000)和良好特异性的MYBA1葡萄多克隆抗体。(4)葡萄果实花色苷含量的变化趋势为先增加后呈平缓趋势,即在花后转色期之前几乎没有积累,在花后转色期开始含量剧增且于花后80天达到最高值,之后趋于稳定。(5)通过对MybAl进行基因表达分析得出：在葡萄各组织中,MybAl在果实中大量表达。果实的花后各时期MybAl的表达规律为在转色前期几乎不表达,进入转色期后表达量剧增,并在转色成熟期即花后80天达到最大值;对MYBA1进行Western-blot分析得出：在葡萄各组织中,MYBA1在叶片中的表达量最高,果实中的表达量最小,卷须、根、茎和芽的表达量介于两者之间且相差不大。果实的花后各时期MYBA1的表达规律为在转色前期几乎不表达,进入转色期后表达量剧增,并在转色成熟期即花后70天达到最大值。(6)相关性分析结果显示：MybA1mRNA含量与MYBA1蛋白的表达呈正相关。MYBA1蛋白的表达量与ANSmRNA、DFRmRNA的含量呈正相关,与UFGTmRNA的含量呈显著正相关;MybA1mRNA含量与DFRmRNA、UFGTmRNA的含量呈显著正相关,与ANSmRNA的含量呈极显著正相关。花色苷含量的积累与MYBA1蛋白表达呈正相关;与ANSmRNA的含量呈正相关,其中与MybA1mRNA、UFGTmRNA、DFRmRNA的含量呈显著正相关。


本文编号：2273018