胰再生基因Reg3g过表达促进NOD小鼠胰岛细胞增殖与诱导机体免疫耐受机制研究

发布时间：2018-11-17 13:00

【摘要】：第一部分1型糖尿病模型DC亚型分化及致病性研究实验背景目前研究认为大多数1型糖尿病是由患者自身免疫系统异常导致胰岛β细胞特异性破坏与损伤,直至胰岛素绝对缺乏,临床上多表现为高血糖,低胰岛素,并伴随有多饮、多食、多尿和体重减轻等症状。在此过程中,患者树突状细胞摄取与呈递胰岛D细胞自身抗原,启动T细胞攻击,最终通过T细胞靶向杀伤破坏胰岛p细胞,导致胰岛素分泌减少,形成糖尿病。在这个过程中,除经典DC(cDC)中CD8α+DC和CD11b+DC之外,人们还在1型糖尿病模型NOD(non-obese diabetic, NOD)小鼠体内发现另一种CD8α-DC亚群,即mcDC。这种DC被认为具有更强的抗原递呈能力和活化抗原特异性杀伤性T细胞能力,破坏NOD小鼠自身免疫耐受,故被认为具有高度致病性。此外,这三种细胞也被认为由相同的前体细胞分化而来。因此,通过动态研究这种三种DC亚群在NOD小鼠发病过程中的分化、组成,以及功能,将有助于深入认识1型糖尿病的发病规律。目的在自发性1型糖尿病模型NOD小鼠中观察不同病程阶段DC亚群分化、构成的变化。重点观察三种DC亚群特性和在T1 D发病过程中扮演的角色；探索体外诱导DC亚群分化的可能,以及探讨DC亚群构成的变化与1型糖尿病发展之间的关联。方法雌性NOD小鼠随机分为3组：6～8周龄组、10～12周龄组、16～18周龄组,每组7只。适应性饲养后取小鼠脾细胞利用流式细胞术测定CD11b+DC (CD11c+CD11b+CD8α-PDCA-1-)、CD8α+DC (CD11c+CD8α+CD11b-PDCA-1-)、mcDC(CD11c+CD11b+CD8-PDCA-1-)亚群的比例与构成；分选上述DC亚群,分别测定其促T细胞增殖能力;ELISA法测定LPS刺激后各DC亚群分泌至上清中细胞因子水平,观察刺激后DC促T细胞增殖能力的变化。分离8周龄NOD小鼠骨髓细胞,体外诱导后比较DC亚群的变化,以及测定培养上清中细胞因子水平。结果与8周龄NOD小鼠脾DC亚群比例相比,第12、1 6周可见CD8a+DC比例显著降低;第16周可见mcDC比例显著增加：在整个观察过程中CD11b+DC比例无显著变化。功能方面,与8周龄NOD小鼠脾DC亚群分泌细胞因子水平相比,CD8a+DC分泌的IL-10、TGF-β、IL-12p70有显著降低;mcDC分泌TNF-α和IFN-γ有不同程度增加,特别是16周时IFN-γ水平呈显著增加;CD11b+DC分泌TNF-α水平显著上升而TGF-β显著下降。mcDC促T细胞增殖能力逐渐增强,第12周和第16周显著强于其余DC亚群；CD11b+DC与CD8α+DC的促T细胞增殖能力无显著差异。骨髓细胞体外培养7天后其CD11b和CD11c分子表达显著增加,其中CD11c增加约40倍,CDllb增加约15%。在DC亚群方面,CD11b+DC增加约20倍,mcDC加4-5倍,CD8α+DC几乎消失。LPS刺激后其IL-12p70？TNF-α、IFN-y和TGF-β的分泌均有显著增加。结论在NOD小鼠病程发展中,伴有CD8a+DC数量减少且功能减弱,mcDC数量增加且功能成熟,以及CD11b+DC功能炎症化趋势。即以CD8a+DC亚群和以mcDC与CD11b+DC为代表的CD8αDC亚群之间的失衡。这表明DC亚群组成及功能变化与NOD小鼠病程密切相关。另一方面,脾脏及骨髓中DC细胞分化及功能分析方法的建立为深入研究DC在NOD小鼠发病进程的作用提供了基础。第二部分1型糖尿病模型Reg3g促进胰岛p细胞增殖机制研究实验背景Reg基因是Akiyama T等发现的一类具有保守C肽凝集素的基因家族,最初发现于再生胰腺组织中。早期研究发现Reg1,2的编码产物可刺激胰腺导管上皮细胞新生为可分泌胰岛素的p细胞；亦可促进胰岛中残余的p细胞增殖。根据基因序列及编码产物的差异,Reg基因家族包括4个亚型。其中,Reg3基因又根据编码长度和蛋白构型差异分为α、β、γ、δ。我们前期研究发现Reg3与胰岛素原双基因质粒可显著延缓STZ诱导的T1 D模型的发病时间和发病率,且体外实验表明Reg3A可直接促进多种人胰腺癌来源的肿瘤细胞增殖。因此,我们设想,与Reg3A有类似结构的Reg3g可能存在促进胰岛细胞增殖的作用。目的观察慢病毒介导的Reg3g基因在NOD小鼠体内表达状况,研究Reg3g表达对胰岛细胞的影响和作用机制。方法8周龄雌性NOD小鼠随机分为3组：对照组(15只)、eGFP-Lv组(20只)、Reg3g-Lv组(20只)。其中对照组给与腹腔注射无菌PBS 200μL,eGFP-Lv组小鼠行腹腔注射eGFP-Lv病毒液200μL,Reg3g-Lv组小鼠行腹腔注射Reg3g-Lv病毒液200μL。其中eGFP-Lv和Reg3g-Lv病毒液用无菌PBS稀释至含2.58×1O6拷贝/200μL。从第8周开始,每周一次,连续4周。第12周每组随机选取5只处死后收集样本,包括血清、胰脏、脾脏、肝脏、肾脏及小肠。取多个内脏切片观察组织荧光表达,激光共聚焦观察胰腺荧光部位及表达强弱。利用HE染色、Tunel检测、PCNA染色、胰岛素染色分析胰岛部位的胰岛炎程度,细胞增殖与凋亡,以及胰岛部位胰岛素合成状况。收集胰腺胰岛,利用Western blot法蛋测定胰岛组织中JAK-STAT信号通路分子的表达。利用ELISA检测血清胰岛素水平。结果与对照组相比,可见HE切片中Reg3g-Lv组胰岛局部淋巴细胞浸润程度降低：免疫组化染色显示胰岛细胞核PCNA阳性细胞显著增加：胰岛细胞凋亡水平无显著变化;胰岛部位胰岛素染色水平有显著提升。第12周血清胰岛素水平有显著上升,第24周血清胰岛素进一步上升。荧光显微镜观察可见Reg3g-Lv组和eGFP-Lv组NOD小鼠肝、胰、脾、小肠均有较显著的绿色荧光。激光共聚焦显微镜结合DAPI染色可见Reg3g-Lv组胰岛有高强度绿色荧光,周边非胰岛胰实质无显著表达。胰岛组织蛋白定量显示,Reg3g-Lv组中有Reg3g过表达；eGFP-Lv组未见Reg3g过表达,与PBS对照组相比无显著变化。在涉及胰岛增殖的信号通路方面,Reg3g-Lv组JAK2、pJAK2、 STAT、pSTAT、NF-κB信号分子表达有不同程度增强,SCOS3表达亦有一定程度升高。截止27周,该组小鼠发病时间显著后移,发病率显著降低。结论Reg3g通过慢病毒介导成功高效地表达于NOD小鼠胰岛细胞,通过活化JAK2/STAT3/NF-KB信号通路促进胰岛p细胞增殖,促进胰岛p细胞合成和释放胰岛素,逐渐恢复血清胰岛素水平。最终延缓该组小鼠T1D发病时间与降低发病率。第三部分1型糖尿病模型Reg3g诱导机体免疫耐受机制研究实验背景1型糖尿病的产生是一个渐进过程。在NOD小鼠模型中,病程早期即可见小鼠胰岛周围出现T细胞、DC、巨噬细胞等免疫细胞的浸润,直接或间接损伤胰岛p细胞。因此,改善机体的免疫失衡、消除或抑制局部炎症将有助于缓解、改善糖尿病发生发展。有关Reg3的前期研究也表明,Reg3可与胰岛素原联合平衡STZ诱导模型小鼠体内‘Th1 /Th2细胞因子的比例,抑制T细胞对胰岛β细胞的破坏。鉴于本研究第二部分中观察到Reg3g-Lv可显著降低NOD小鼠胰岛的淋巴细胞浸润程度,延缓发病时间与降低T1D发病率,我们认为Reg3g-Lv还可能抑制细胞免疫功能诱导小鼠免疫耐受的形成与维持,保护p细胞,延缓T1DM发病。目的利用NOD小鼠模型,观察Reg3g-Lv因素对小鼠树突状细胞和T淋巴细胞亚群数量及功能的影响,以及DC和T细胞的相互影响。结合小鼠血清中细胞因子和抗胰蛋白酶(al-AAT)结果探讨Reg3g-Lv改善NOD小鼠免疫耐受的可能机制。方法收集第二部分中12周龄PBS组、eGFP-Lv组、Reg3g-Lv组脾来源DC、T细胞、血清样本。流式细胞术检测各组DC亚群及成熟度。半体外观察DC功能,包括混合淋巴细胞反应和诱导胸腺T细胞分化为Treg (CD4+CD25+Foxp3+)能力实验。ELISA检测LPS刺激DC后分泌1L-10、TGF-β、IL-12p70和α1-AAT水平。流式细胞术测定脾淋巴细胞中Treg亚群比例。半体外测定T细胞增殖能力和Th1/Th2细胞因子分泌水平.ELISA检测血清中Th0/Th2细胞因子和α1-AAT水平。利用Western blot法测定肝脏JAK-STAT信号通路活化程度。体外观察Reg3g蛋白对DC膜表面分子和T细胞增殖能力的影响。结果Reg3g-Lv组脾DC比例与PBS组和eGFP-Lv组的结果无显著差异,但Reg3g-Lv组DC共刺激分子CD40、CD80、CD86有显著降低。在DC亚群方面,该组CD11b+DC比例显著降低,而mcDC和CD8α+DC无显著变化。该组脾DC刺激T细胞增殖能力显著减弱,而诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞能力有显著增强。DC上清中IL-10和TGF-β水平显著上升,IL-12p70显著下降,α1-AAT无显著变化。Reg3g-Lv组脾淋巴细胞中Treg比例显著增加,增幅达20%。该组T细胞增殖能力显著减弱,T细胞培养上清中TGF-β和IL-10水平有显著升高,IFN-γ和IL-2水平显著降低。Reg3g-Lv组NOD小鼠血清α1-AAT水平显著升高。蛋白定量结果显示肝脏中与α1-AAT合成有关的JAK2/STAT3/NF-κB信号通路有活化。未发现Reg3g蛋白对DC膜表面分子和T细胞增殖能力的直接影响。结论体内Reg3g过表达有助于诱导DC不成熟,促进其免疫抑制性细胞因子的分泌,直接或间接诱导Treg分化;此外,还通过促进具有抗炎作用的α1-AAT的合成及分泌,发挥抗炎和促进胰岛p细胞修复。结果提示Reg3g-Lv可通过促进自身免疫耐受,抑制NOD小鼠的细胞免疫反应,发挥抗T1DM作用。综合以上三部分的结果,本研究显示NOD小鼠体内Reg3g过表达具有双靶向功能：既可促进胰岛β细胞增殖、恢复其分泌胰岛素功能,又可诱导与维持NOD小鼠机体的自身免疫耐受。此基因治疗延缓NOD小鼠的发病时间,降低发病率,为1型糖尿病的防治提供新的线索与方向。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1

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