基于高通量测序技术探究MCD病理特征形成中基因突变作用

发布时间：2019-01-12 09:55

【摘要】：癫痫是一种多病因引起大脑皮层神经元异常超同步化放电,致使中枢神经系统短暂功能障碍的慢性疾病,是危害我国人民身心健康的常见疾病之一,年发病率在7.0‰左右。癫痫的发病人群主要分布在儿童及青少年,大多数患者经过一线抗癫痫药物治疗可以达到临床缓解,但是仍有大约30%患者会发展为药物难治性癫痫。据国内最新回顾性研究报道,我国接受难治性癫痫外科手术的患者中,脑皮质发育不良(malformations of cortical development, MCD)患者约占60%;其中小于3岁的儿童药物难治性癫痫病患中,MCD所占比例几近80%。因此,有效阐明MCD的病理发生及相关癫痫发生的分子学机制,对于难治性癫痫的早期诊断及个性化治疗具有重要意义。MCD癫痫病灶均存在典型病理学改变,其共同特征包括大脑板层结构紊乱和灰白质交界不清。脑皮质发育不良亚型较多,其中临床最常见的类型为局灶皮质发育不良(focal cortical dysplasia, FCDs)、头小畸形(polymicrogyria)、结节性硬化症(tuberous sclerosis complex, TSC)等。2011 年,国际抗癫痫联盟(international league against epilepsy,ILAE)根据专家联合讨论,提出最新FCDs分类标准:根据病理及影像学表现可大体分为单纯型与混合型。对于单纯型FCDs,其包括FCDⅠ型和FCDⅡ型,病理表现为板层紊乱、皮白交界模糊(FCD Ⅰ,Ⅱ)及散布异形神经元(DNs)和气球样细胞(BCs) (FCDⅡ)。另一种常见MCD类型,TSC通常认为是一种常染色体显性遗传全身性疾病,其中枢神经系统病理改变与FCD Ⅱ型类似,特别是FCDⅡb型,包括板层结构消失、灰白质交界模糊、结节内散布大量DNs及巨大细胞(giant cells, GCs)。近年研究发现,FCDs致痫机制十分复杂,涉及到众多因素如离子通道异常、过度炎性反应及胞外基质成分异常等。至今学术界仍然没有找到其主效致病因素,考虑到FCDs大多散发的分布特征,并且有报道显示FCDs存在某些特征性基因突变,这强烈提示我们可能存在特定核苷酸突变导致该疾病的发生发展。深入探索FCDs疾病的主效致病基因,可能为FCDs患者的诊断和治疗提供更多的帮助。更进一步,探索DNA改变引起的下游功能学改变更加重要,转录组高通量技术的兴起,使得基因功能学研究更加高效便捷,可以为我们深入了解FCDs相关致病基因功能提供有力的支撑,将有助于人们进一步认识和阐明FCD的病理发生及致痫机制。目前针对MCD患者相关癫痫的治疗,临床常用抗癫痫药物大多以选择性离子通道为作用靶点,而针对非选择性离子通道相关研究报道不多。近年来,学者更多地将研究焦点放在非选择性离子通道家族(Transient receptor potential channels, TRP channels),该家族成员主要定位在细胞膜系统中,通过内源性及外源性物质活化,介导胞膜阳离子非选择性通过。目前已发现的TRP通道主要包括TRPA、TRPC、TRPV及TRPM等7大类,共计30个离子通道。其中,TRPC通道作为TRP通道家族重要成员,广泛表达于哺乳动物脑组织中,并且主要分布在神经元、胶质细胞及内皮细胞中。既往研究发现,TRPC4可以通过Ca2+介导海马神经元突起生长与凋亡并且可以调控小鼠海马神经元“痫样放电”。同时,TRPC4也参与到神经元兴奋抑制性递质释放过程,过度激活可以扰乱皮质内“兴奋/抑制”平衡。以上研究结果,强烈提示TRPC4可能是参与到癫痫发生发展的重要通道蛋白,其在MCD样本中的表达模式及作用机制研究对于MCD相关癫痫的治疗具有深远意义。本研究中,我们以FCDⅡ型临床样本为研究对象,采用外显子测序(Exome-seq)、转录组测序(RNA-seq)及生物信息学方法,对FCD Ⅱ型样本的外显子区突变及其下游转录信息进行全面系统的检测与分析,得到准确可靠的遗传学及功能学信息。同时,我们采用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学等技术手段,研究了 TRPC4及其上游分子PLCD1 (phospholipase C delta1)在MCD标本中的表达分布,分析了 TRPC4信号通路在MCD致痫灶中的潜在作用机制。主要结果如下:一、基于外显子测序技术的FCDs基因突变分析1.本部分研究,我们采用外显子测序及生物信息学手段,对FCD Ⅱ型及正常对照样本外显子区序列进行分析,我们发现众多FCD Ⅱa特异性、FCD b特异性及FCD Ⅱ共同基因突变,包括GABA能抑制性通路、mTOR信号通路、细胞周期相关通路及TRP家族相关通路;2.对于FCD Ⅱ型样本的单核苷酸变异进行分析,我们发现FCD Ⅱa中存在特异性神经细胞瘤断裂点家族突变基因NBPF4、NBPF10、NBPF14及NBPF15突变,FCDⅡb中存在GABA能抑制性基因SLC6A11、SLC12A5突变,FCD Ⅱa与FCD Ⅱb共同突变包括mTOR通路中mTOR、PTEN基因和周期相关CDC27基因无义突变,以上突变涉及神经系统发育及癫痫发生的重要过程,可能是FCDⅡ型病理发生及癫痫发作的重要致病基因。3.对于FCD Ⅱ型样本的拷贝数变异进行分析,我们发现FCDⅡa特异拷贝数变异富集到轴突导向过程,涉及基因包括EFNB2、EFNA1、PLXNA1及NTNG2。而FCDⅡb样本中,拷贝数变异主要分布在mTOR信号通路与泛素化过程,包括TSC1、TSC2及CDC27基因拷贝数缺失。二者共同的拷贝数变异主要发生在TRP家族成员基因,包括TRPV1、TRPV4及TRPC4及FCD Ⅱ型中存在的基因拷贝数变异分布于细胞增殖、分化以及神经元电活动等生物学过程中,这些拷贝数变异可能会上调/下调相关基因的表达,从而参与到FCD Ⅱ型疾病的发生发展中。二、基于RNA-seq测序技术的FCDs基因转录谱分析1.本部分研究,我们选取FCD Ⅱa、FCD Ⅱb及正常脑组织为研究对象,运用转录组测序及生物信息学技术,系统研究了 FCD Ⅱ型标本的转录谱。我们发现,测序研究得到的数据与既往研究一致性较好,并分析筛选得到FCD Ⅱa及Ⅱb共差异表达基因464个、FCD Ⅱa特异性差异基因536个和FCD Ⅱb特异性差异基因687个;2.通过对FCD Ⅱ型中464个共同差异表达基因,进行功能聚类分析,我们发现差异基因主要富集到血管生成、阳离子运输和P2嘌呤受体通路,涉及重要基因包括VEGFA、KCNJ10、CACNG4、TRPV1、TRPC4、P2X7R 及 P2Y12R。通过文献回顾,我们分析得到以上基因可能参与到FCD Ⅱ型相关癫痫疾病发生发展过程,并可能成为难治性癫痫特异性治疗的新靶点;3.通过对FCD Ⅱ亚型中特异性表达基因进行聚类分析,我们得到FCD Ⅱa相关差异表达基因主要聚类到离子通道相关通路,主要涉及SLC13A5、SLC1A6、GRIN3A、NMUR2及KCNK5基因;FCD Ⅱb特异性表达主要集中在细胞周期及中枢神经系统发育等通路,其中包括CDKN1C、CDKN2A及GDNF基因,这些基因的特异性表达为我们理解FCD Ⅱ亚型的特异性病理改变,提供了更多分子生物学证据及可靠的研究方向。三、TRPC4在MCD临床标本中的表达与分布1.本部分研究,利用RT-PCR及Wesern Blot技术,我们发现正常脑组织内TRPC4 mRNA及蛋白均有表达,进一步免疫组织化学结果显示,TRPC4蛋白主要分布在神经元、胶质细胞及血管内皮细胞中,并呈弱阳性表达;2.在MCD病灶组织中,TRPC4在FCDⅡa、FCD Ⅱb和TSC亚型的mRNA及蛋白表达水平均明显高于正常脑组织(P 0.01)。进一步免疫组化及免疫荧光双标研究发现,TRPC4蛋白在DNs、BCs、GCs、星型胶质细胞及内皮细胞中呈强阳性表达,与对照组相比有显著统计学差异(p0.01)。除此之外,TRPC4在MCD病灶中的vGlut1、GABA及GAD65+67阳性的中间神经元内均有分布。以上结果提示TRPC4在MCD致痫灶中可能起到重要作用;3.进一步研究表明,TRPC4上游互作分子PLCD1,在正常大脑皮层及MCD致痫灶内均有表达,且PLCD1在MCD各亚型中的表达与对照组相比具有显著地统计学差异(p 0.01)。进一步免疫组化相关结果显示,PLCD1高表达于MCD病灶中的异形细胞DNs、BCs和GCs中,这提示我们MCD病灶内可能是PLCD1调控TRPC4表达与功能作用,并参与到MCD致痫过程中。综上所述,本研究结果表明:1.在FCD Ⅱ型患者病灶中,存在大量潜在致病基因突变,其中mTOR信号通路基因mTOR、PTEN、TSC及细胞周期相关基因CDC27突变可能参与到FCD Ⅱ型板层紊乱、异形细胞形成的病理改变过程中,GABA抑制性通路及TRP家族相关基因SLC6A11、SLC12A5及TPRC4突变则可能造成FCD Ⅱ型高癫痫易感性的病理特征;2.我们首次采用转录组测序手段,对FCD Ⅱ型疾病转录谱进行系统描绘,其中细胞周期、中枢神经系统发育通路相关基因CDKN1C及CDKN2A异常表达可能参与到FCD ⅡI特异性气球样细胞的病理形成过程,同时,离子通道相关基因SLC13A5、SLC1A6、KCNK5及TRPC4及的表达异常可能造成FCD Ⅱ型脑区兴奋抑制失衡,导致相关癫痫的发生发展;3.进一步研究发现,TRPC4及其上游互作分子PLCD1在MCD临床标本中表达水平显著增加,并主要分布于异构神经元、血管内皮及反应性胶质细胞中。综合以上结果,我们推断:mTOR信号通路、细胞周期调控通路及离子通道对于FCD疾病的病理形成及癫痫发作起到极其重要的作用,同时,TRPC4在MCD癫痫发作过程中起到重要的致痫作用并作为MCD相关癫痫治疗的新靶点。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.1

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