加工番茄SlAGO4A基因功能的初步研究

发布时间：2019-07-12 16:28

【摘要】：加工番茄作为重要的经济作物之一,具有重要的开发利用价值,病毒病害是影响加工番茄产量和品质的主要病原之一,导致加工番茄减产甚至绝产。新疆加工番茄上主要的病毒包括:To MV、CMV、PVY以及STV,其中CMV和PVY对番茄植株产生严重的危害。RNA沉默是植物自主抵御病毒侵染的主要防御手段,其在植物抗病毒具有重要作用,RNA沉默复合体(RNA induced silencing complex;RISC)是RNA沉默中的主要元件,可以介导靶基因m RNA的特异性切割,从而达到RNA沉默效果,Argonaute(AGO)蛋白是组成RNA沉默复合体的核心蛋白,是RNA沉默所必需的。AGO蛋白首次在植物中被发现,是一类高度保守的碱性蛋白,其蛋白家族成员均具有四个结构域,分别为:N端结构域,PIWI结构域,PAZ结构域以及MID结构域。其中PAZ结构域主要识别si RNA 3′端突出的2个碱基,负责与RNA结合;PIWI结构域在结构和功能上与RNase H相似,RISC具有核酸内切酶的活性,切割靶基因。AGO蛋白家族成员被分为两个亚组,分别为AGO亚组和PIWI亚组,不同物种中AGO蛋白家族成员的数目各不相同,其主要功能也存在较大差异。目前,番茄中已知的AGO蛋白家族成员有八个,其中SlAGO1A和SlAGO1B可能影响植株高度和开花时间,SlAGO7被发现可能与叶和花器官的形成有关,SlAGO4A被发现与植物抗逆有关。目的:本研究以加工番茄AGO4A为研究对象,通过酵母双杂交验证其与PVY HC-Pro以及CMV 2b的相互作用;亚细胞定位、过量表达和干扰转基因植株的获得;为进一步研究其功能提供初步依据。方法:将SlAGO4A基因与已知功能的AGO蛋白家族成员进行蛋白结构域的氨基酸序列比对构建进化树,并通过SMART进行蛋白结构域分析。通过Gen Bank中查找SlAGO4A序列以及本实验室的PVY HC-Pro以及CMV2b序列,利用GAL4酵母双杂交系统中诱饵载体和目的载体序列设计引物,构建诱饵载体和目的载体,通过酵母双杂交系统说明书所提供的实验方法进行酵母双杂交实验。根据SlAGO4A基因序列和亚细胞定位载体序列设计合成引物,构建GFP融合载体,并利用农杆菌介导法进行烟草遗传转化。通过激光共聚焦显微镜观察GFP荧光。通过SlAGO4A基因序列和PIWI蛋白结构域基因序列构建过量表达载体和干扰载体,利用农杆菌侵染法进行番茄遗传转化,利用q RT-PCR技术对过量表达转基因番茄植株进行目的基因的相对表达量分析。结果:系统发育分析显示,SlAGO4A与拟南芥At AGO4氨基酸相似性较高,归于At AGO4亚组。SlAGO4A具有AGO蛋白家族成员所共有N端结构域、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域,此外也具有DUF1785和Argo L2结构域。成功构建诱饵表达载体BD-CMV 2b、BD-PVY HC-Pro以及目的表达载体AD-SlAGO4A通过GAL4酵母双杂交系统初步判断SlAGO4A与PVY HC-Pro和CMV 2b并无相互作用。成功构建GFP融合表达载体35S:GFP-SlAGO4A,遗传转化烟草植株,共获得5个转基因烟草株系,激光共聚焦显微镜观察结果表明,SlAGO4A定位于细胞核和保卫细胞膜上。成功构建过量表达载体35S:SlAGO4A以及干扰载体35S:Ri PIWI,遗传转化番茄植株,并获得6株过量表达转基因番茄植株和5株干扰转基因番茄株系,获得的所有转基因番茄植株中SlAGO4A基因的表达量均有明显升高,相比正常植株来说增长量大约在6-76×之间波动,证明成功获得过表达植株。结论:通过系统发育结果我们推测SlAGO4A基因可能与At AGO4功能相似,根据酵母双杂交实验我们初步判断SlAGO4A与PVY HC-Pro以及CMV2b无相互作用。成功获得5个GFP融合转基因株系,并通过荧光观察确定SlAGO4A定位于细胞核和保卫细胞膜上,成功获得6个过量表达及5个干扰转基因番茄株系。为研究其功能奠定基础,有助于深入研究番茄中该基因提供了理论基础。
文内图片：
图片说明： 600=0.01；取 2μL 点样于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 平板上，d，观察结果。表 2.2 诱饵蛋白和对照检测质粒共转化组配Table 2 Verification of Bait plasmid suitability for CytoTrap interaction a 结果与分析.1 PVY HC-Pro、CMV2b 和 SlAGO4A 基因的扩增 质粒组合 质粒用量 感受BD + AD 100 ng 100μBD + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD-SlAGO4A 100 ng 100μ
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图片说明： 600=0.01；取 2μL 点样于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 平板上，，d，观察结果。表 2.2 诱饵蛋白和对照检测质粒共转化组配Table 2 Verification of Bait plasmid suitability for CytoTrap interaction a 结果与分析.1 PVY HC-Pro、CMV2b 和 SlAGO4A 基因的扩增 质粒组合 质粒用量 感受BD + AD 100 ng 100μBD + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD-SlAGO4A 100 ng 100μ
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S641.2

【参考文献】

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4 郭s

本文编号：2513827