芽孢杆菌产抗菌脂肽合成酶基因检测及基因敲除研究

发布时间：2019-07-12 19:12

【摘要】：抗菌脂肽类化合物主要是芽孢杆菌通过生物合成途径合成的一类低分子量代谢产物。随着分子生物学研究手段的不断进步,人类已经逐渐了解并掌握脂肽类化合物生物合成的规律。大多数脂肽类化合物的合成都是由非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthase,NRPS)基因簇调控。本研究首先确定脂肽类化合物NRPS生物合成过程的编码基因,以实验室保藏的11株枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌作为研究对象,通过分子克隆技术对其编码基因进行检测,并辅以高效液相检测(High performance liquid charomatography,HPLC)进行验证,从而推测芽孢杆菌生物合成抗菌脂肽类化合物的潜在能力。基于以上手段,我们建立了一种抗菌脂肽产生菌快速识别、筛选和抗菌脂肽快速鉴定的方法。另一方面,NRPS的模块化结构和非常规线性化装配模式决定了其终产物结构的多样性和活性的丰富性。本研究利用组合生物合成技术,对实验室保藏的一株Plipastatin产生菌Bacillusllubtilis PB2进行分子改造,分别对其具有底物选择专一性的ppsC-A2结构域、具有完整功能的ppsC-Glu模块以及独立酶活性的ppsC亚基结构进行敲除,构建NRPS杂合酶系,探索新型脂肽类化合物的形成,并探究结构域、模块与亚基的缺失对诱导出现NRPS模块跳跃现象的影响及相互关系。然后针对出现模块跳跃现象的ppsC-A2结构域敲除菌株上下游ppsC-C2结构域和ppsC-PCP2结构域进行敲除,研究各个结构域及模块间的相互作用和联系,进一步探究脂肽类化合物模块跳跃现象的出现与复合酶系调控生物合成传递间的关系。主要研究结果如下:1.基于聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction,PCR)和HPLC检测技术建立了一种抗菌脂肽产生菌快速识别、筛选方法.通过扩增抗菌脂肽类化合物合成酶编码基因与脂肽类化合物HPLC检测,证实了枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌均具有多种抗菌脂肽合成酶编码基因(如sfp、srfAA、srfAD、fenA、fenB、ferD、ituD、ituA、ituB、albF、albA、pmxB、pmxC、pmxE、bmyA、bmyB、bmyC),推测它们均具有合成多种抗菌脂肽类化合物的潜力(如Surfactin、Fengycin、Iturin、BacillomycinD、SubtilosinA、Polymyxin)。但是某些脂肽类化合物因合成产量过低或合成过程受阻而未被HPLC检测发现,其具体原因有待研究。基因检测结果同样证实了不同种属的菌株具有不同或相同的抗菌脂肽类化合物合成酶编码基因,而同一种细菌的不同菌株之间具有的抗菌脂肽类化合物合成酶编码基因也不尽相同。因此,该技术同样可以运用于寻找不同种属细菌之间的同源性基因。2.利用组合生物合成策略构建ppsC-A2结构域、ppsC-Glu模块、ppsC亚基敲除菌株.通过重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)获得敲除位点上、下游基因融合片段,成功构建了枯草芽孢杆菌敲除载体。将敲除载体转入B.subtilis.PB2感受态细胞中,诱导无标记同源重组敲除,获得两步单交换成功的重组敲除菌株。对敲除菌株进行HPLC分析,ppsC-A2结构域敲除菌株Plipastatin生物合成过程出现模块跳跃现象,并在其发酵液中发现一种新型抗菌脂肽类似物。经高分辨率质谱(High-resolution mass spectrometry,HR-ESI-MS)与二级质谱(Tandem mass spectrometry,MS/MS)分析,确定该物质为缺少第六模块丙氨酸(Alanine,Ala)的Plipastatin线性类似物。ppsC-Glu模块敲除菌株和ppsC亚基敲除菌株Plipastatin合成过程受阻,合成释放Plipastatin能力明显下降。同时两株重组菌株未出现模块跳跃现象,未发现有新型抗菌脂肽类化合物产生。3.利用无标记同源重组方法构建ppsC-C2结构域和ppsC-PCP2结构域敲除菌株.ppsC-PCP2结构域敲除菌株HPLC检测出现与ppsC-A2结构域敲除菌株相似峰型,出现模块跳跃现象,合成了同样的缺少第六模块Ala的Plipastatin类似物。而ppsC-C2结构域敲除菌株Plipastatin合成过程受阻,无任何产物合成,未出现模块跳跃现象。说明模块跳跃现象的出现主要与A结构域和PCP结构域有关。
文内图片：图１－１邋／ｅ？操纵子与操纵子合成机制逡逑－

图片说明：的肽单体酶。而＾４Ｚ）基因与脂肽链的内酯化相关。逡逑１．２逦Ｆｅｎｇｙｃｉｎ／Ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ邋合成机理逡逑编码Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的调控基因由知？操纵子组成１２９１（图１－１），包括逡逑声和知？５邋５个基因，它们分别控制合成编码Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶的５个单体酶。Ｆｅｎｇｙｃｉｎ逡逑合成酶一共包括１０个模块，每个模块单独活化一种氨基酸，这些氨基酸依次连接成完逡逑整的脂肽链。Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成过程由ＦｅｎＣ^u始，经ＦｅｎＤ、ＦｅｎＥ、ＦｅｎＡ的传递，最终由逡逑ＦｅｎＢ的ＴＥ结构域终止合成，，释放完整肽链。而Ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ是由５．逦１６８菌株产生逡逑的一类与Ｆｅｎｇｙｃｉｎ结构性质十分相似的抗菌脂肽类物质，其操纵子合成机制与片／７操纵逡逑子类似［３１，３２］。逡逑￣Ｆ逦？逦ｐｐ逦ｐｐ逦ｐｐｐ逦ｐ逡逑Ｃｌ邋Ａｔ邋ｃ邋Ｃ２逦Ａ２逦：邋Ｅ逦Ｃｌ邋Ａｌ逦ｃ邋＾邋Ａ２邋ｃ逦Ｅ邋Ｃｌ邋Ａｌ逦ｃ邋＾邋Ａ２邋ｃ邋Ｅ逦Ｃｌ逦Ａｌ邋Ｃ邋Ｃ２邋Ａ２邋Ｃ邋0邋Ａ３邋Ｃ逦Ｅ邋Ｃｌ逦Ａｌ邋Ｃ逦ｐｇ逡逑ＰＩ逦＞２逦Ｐ１逦Ｐ：逦Ｐｉ逦Ｐ２逦ＰＩ邋Ｐ７邋Ｐ３逦Ｐｉ逡逑块块块０l捒榭椋犊椤峰义希牵欤蹂澹希椋椋殄危裕埽蝈危裕欤簦驽危澹牵瑁殄澹粒欤徨澹郑幔戾危校颍镥澹牵欤椋殄澹裕埽蝈危桑簦翦义稀担穑穑螅粒剩瑁椋缅危掊澹穑穑簦洛澹妫澹睿腻濉怠担浚茫妫ⅰ赍巍峰沃埃皚0邋—〉逡逑图１－１邋／ｅ？操纵子与操纵子合成机制逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏｒｇａｎｉｚａｎｔｉｏｎ邋ｏｆｆｅｎ邋ｏｐｅｒｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｐｓ邋ｏｐｅｒｏｎ逡逑１．３逦Ｉｔｕｒｉｎ合成机理逡逑根据前人的报道［３３］
文内图片： Surfactin生物合成基因簇及删除模块2原理图[49]

图片说明：３．４ＮＲＰＳ线性催化的装配模式决定了模块与氨基酸残基之间线性对应的关系。对ＮＲＰＳ模块化结构进行敲除，其最终脂肽类化合物的结构性质也会发生相应的在研究过程中，通常通过同源重组技术对ＮＲＰＳ途径中特定的结构域或模块进行首先需要构建含待敲除区域上下游序列的特定敲除质粒，然后将敲除质粒导入株中，与原始菌株基因组发生同源双交换，上下游间敲除位点的序列将被完全从而使ＮＲＰＳ失去敲除基因的功能，导致其无法参与ＮＲＰＳ合成途径合成正常的谢产物，终产物的结构域功能因此而发生变化。逡逑Ｍｏｏｔｚ等人对Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ合成酶基因簇第２模块进行敲除，敲除菌株可以合成置氨基酸缺失的衍生物（图１－３），但是产量较原始菌株大大下降［１￣。在对ＹＭ－２１６３９１的基因簇异源表达研究中发现，敲除其负调控基因的突变基因表达株产量提高了邋２０倍［１（）２］。近年来，在对他克莫司基因敲除回补研究中得到多因敲除突变株［１（）３］，获得多种活性大小不一的他克莫司类似物。此外，还可以在掉ＮＲＰＳ某些功能模块的基础上插入异源模块进行表达，也可以获得新型脂肽物。比如前文所述的达托霉素在敲除办／Ｄ编码基因后，插入其它脂肽类化合物的进行表达，得到了达托霉素结构类似物［９４，１（）４］。逡逑
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936;Q78

【参考文献】