水稻OsAAA1基因启动子的分离与克隆
发布时间：2019-09-24 13:05
【摘要】：水稻稻瘟病抗性新基因OsAAA1是一种诱导型的广谱抗病基因,但OsAAA1的表达模式及调控机理未知。为了研究OsAAA1的表达模式及调控机理,通过对OsAAA1启动子序列的生物信息学分析,克隆了3个OsAAA1启动子区域的缺失体,将上述缺失体转入植物双元表达载体DX2181G中。通过菌落PCR、质粒PCR检测和质粒DNA酶切鉴定并测序确认,结果表明以上3个启动子系列缺失载体构建成功。为进一步研究OsAAA1启动子的表达模式及该基因的调控机理提供了参考依据。
【图文】：
克隆质粒均切出了载体带和目的带，为阳性质粒(图4)。菌落PCR和质粒酶切鉴定为阳性的克隆经Sanger测序正确后保存，，综合以上结果表明OsAAA1启动子缺失系列片段载体构建成功。2讨论本研究成功构建了3个启动子缺失系列载体，下一步是将成功构建的载体进行农杆菌介导的遗传转化，转基因植株阳性鉴定后，进行GUS组织化学染色和GUS酶活荧光定量分析来研究OsAAA1启动子的表达模式和OsAAA1基因的调控机制。通过对OsAAA1启动子序列进行生物信息学分析，发现该启动子含有多种与植物抗病性有关的顺式作用元图2启动子缺失片段P0重组载体菌落PCR鉴定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP0Note:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0图3启动子缺失片段P1和P2重组载体菌落PCR鉴定注:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1Figure3ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP1andP2Note:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1图1OsAAA1基因启动子缺失片段的PCR扩增注:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P2Figure1PCRamplificationofOsAAA1genepromoterdeletionfragmentsNote:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P22908
表达载体DX2181G，以期研究OsAAA1基因的表达模式，为进一步阐释该基因的调控机理提供了参考依据。1结果与分析1.1OsAAA1启动子缺失片段的克隆以日本晴基因组DNA为模板扩增OsAAA1启动子区域的缺失体P0、P1、P2(图1)，其大小分别为2893bp、1099bp、506bp。PCR扩增结果表明，目的条带大小与预期一致，可以用于后续实验。1.2菌落PCR检测将克隆到的目的片段回收后与载体DX2181G质粒DNA连接，挑取单克隆进行菌落PCR检测，结果显示扩增得到的目的带大小依次为2893bp、1099bp、506bp(图2;图3)。P0片段重组载体3个单克隆均扩出目的带，P2片段重组载体3个单克隆有2个扩出目的片段，P1片段重组载体3个单克隆均扩出目的片段。1.3质粒酶切检测将菌落PCR检测到的阳性克隆扩大培养后提取质粒DNA，用SalⅠ酶进行酶切检测，P0挑取了3个单克隆质粒，P1、P2均挑取2个单克隆质粒，结果显示：以上7个单克隆质粒均切出了载体带和目的带，为阳性质粒(图4)。菌落PCR和质粒酶切鉴定为阳性的克隆经Sanger测序正确后保存，综合以上结果表明OsAAA1启动子缺失系列片段载体构建成功。2讨论本研究成功构建了3个启动子缺失系列载体，下一步是将成功构建的载体进行农杆菌介导的遗传转化，转基因植株阳性鉴定后，进行GUS组织化学染色和GUS酶活荧光定量分析来研究OsAAA1启动子的表达模式和OsAAA1基因的调控机制。通过对OsAAA1启动子序列进行生物信息学分析，发现该启动子含有多种与植物抗病性有关的顺式作用元图2启动子缺失片段P0重组载体菌落PCR鉴定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragm
【作者单位】： 中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室生物技术国家民委重点实验室;
【基金】：国家转基因重大专项(2014ZX0800904B) 国家自然科学基金面上项目(31370306)共同资助
【分类号】：Q943.2;S511
【图文】：
克隆质粒均切出了载体带和目的带，为阳性质粒(图4)。菌落PCR和质粒酶切鉴定为阳性的克隆经Sanger测序正确后保存，，综合以上结果表明OsAAA1启动子缺失系列片段载体构建成功。2讨论本研究成功构建了3个启动子缺失系列载体，下一步是将成功构建的载体进行农杆菌介导的遗传转化，转基因植株阳性鉴定后，进行GUS组织化学染色和GUS酶活荧光定量分析来研究OsAAA1启动子的表达模式和OsAAA1基因的调控机制。通过对OsAAA1启动子序列进行生物信息学分析，发现该启动子含有多种与植物抗病性有关的顺式作用元图2启动子缺失片段P0重组载体菌落PCR鉴定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP0Note:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0图3启动子缺失片段P1和P2重组载体菌落PCR鉴定注:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1Figure3ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP1andP2Note:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1图1OsAAA1基因启动子缺失片段的PCR扩增注:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P2Figure1PCRamplificationofOsAAA1genepromoterdeletionfragmentsNote:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P22908
表达载体DX2181G，以期研究OsAAA1基因的表达模式，为进一步阐释该基因的调控机理提供了参考依据。1结果与分析1.1OsAAA1启动子缺失片段的克隆以日本晴基因组DNA为模板扩增OsAAA1启动子区域的缺失体P0、P1、P2(图1)，其大小分别为2893bp、1099bp、506bp。PCR扩增结果表明，目的条带大小与预期一致，可以用于后续实验。1.2菌落PCR检测将克隆到的目的片段回收后与载体DX2181G质粒DNA连接，挑取单克隆进行菌落PCR检测，结果显示扩增得到的目的带大小依次为2893bp、1099bp、506bp(图2;图3)。P0片段重组载体3个单克隆均扩出目的带，P2片段重组载体3个单克隆有2个扩出目的片段，P1片段重组载体3个单克隆均扩出目的片段。1.3质粒酶切检测将菌落PCR检测到的阳性克隆扩大培养后提取质粒DNA，用SalⅠ酶进行酶切检测，P0挑取了3个单克隆质粒，P1、P2均挑取2个单克隆质粒，结果显示：以上7个单克隆质粒均切出了载体带和目的带，为阳性质粒(图4)。菌落PCR和质粒酶切鉴定为阳性的克隆经Sanger测序正确后保存，综合以上结果表明OsAAA1启动子缺失系列片段载体构建成功。2讨论本研究成功构建了3个启动子缺失系列载体，下一步是将成功构建的载体进行农杆菌介导的遗传转化，转基因植株阳性鉴定后，进行GUS组织化学染色和GUS酶活荧光定量分析来研究OsAAA1启动子的表达模式和OsAAA1基因的调控机制。通过对OsAAA1启动子序列进行生物信息学分析，发现该启动子含有多种与植物抗病性有关的顺式作用元图2启动子缺失片段P0重组载体菌落PCR鉴定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragm
【作者单位】： 中南民族大学生命科学学院武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室生物技术国家民委重点实验室;
【基金】：国家转基因重大专项(2014ZX0800904B) 国家自然科学基金面上项目(31370306)共同资助
【分类号】：Q943.2;S511
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本文编号：2540879
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