多粘类芽胞杆菌纤维素酶基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

发布时间：2019-10-15 22:04

【摘要】：【目的】本研究以多粘类芽胞杆菌为实验对象,通过共表达β-葡萄糖苷酶bgl A与bgl B基因,有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性;又将多粘类芽胞杆菌的bgl A、bgl B及内切β-葡聚糖酶基因EG分别连接乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)分泌型表达载体p NZ-X(p NZ8048::usp45),获得分泌型乳酸菌重组菌株,为重组纤维素酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案,为秸秆的降解研究奠定了基础。【方法】(1)根据Gen Bank上的多粘类芽胞杆菌bgl A、bgl B、EG基因序列设计引物,以多粘类芽胞杆菌总DNA为模板,扩增bgl A、bgl B、EG基因片段,与p Bluescript II KS(+)载体连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性克隆后,提取质粒并做双酶切和测序鉴定;从阳性重组质粒经酶切获得bgl A、bgl B、bgl基因片段,连接p ET-28a载体后转化大肠杆菌C41,构建工程菌株命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1:1、1:2、2:1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。(2)根据Gen Bank上的乳酸菌L.lactis MG1363基因序列设计引物,以L.lactis MG1363总DNA为模板,扩增usp45基因片段,与p MD18-T连接后转化大肠杆菌DH5α,经质粒双酶切和测序鉴定后,从阳性重组质粒经酶切获得usp45片段,连接p NZ8048后转化大肠杆菌DH5α,获得分泌型表达载体p NZ-X。(3)将测序正确的多粘类芽胞杆菌bgl A、bgl B、EG基因从阳性重组质粒上切下,分别连接p NZ-X后转入大肠杆菌DH5α,经验证正确后,提取重组质粒电转至L.lactis NZ9000中,经乳酸链球菌肽(nisin)诱导,测定分泌性表达的Bgl A、Bgl B和EG的酶活性。【结果】(1)重组β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中表达:SDS-PAGE电泳图显示Bgl A和Bgl B的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,EAB菌株共表达的Bgl大小为100ku,表明Bgl A和Bgl B在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明,共表达Bgl与多粘类芽胞杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其它组分酶活(P0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。(2)纤维素酶基因在乳酸菌中表达:Bgl A、Bgl B和EG三个酶大小均在50ku;DNS法测定酶活表明重组菌株的酶活显著低于多粘类芽胞杆菌的酶活(P0.05),但具有一定的活性;刚果红染色结果也表明重组乳酸菌分泌产生的酶可产生明显的水解圈。【结论】(1)本研究将β-葡萄糖苷酶两个亚基bgl A和bgl B在大肠杆菌C41中共表达后,其酶活比单一酶组分及混合表达的酶活提高了四倍,与原始菌株酶活差别不显著。(2)本研究分别克隆了多粘类芽胞杆菌的β-葡萄糖苷酶基因bgl A、bgl B及内切葡聚糖酶基因EG,并分别与连有信号肽序列的分泌型表达载体相连接,成功构建了分泌型表达载体p NZ-X::bgl A、p NZ-X::bgl B及p NZ-X::EG。
【图文】：

重组质粒 pET-28a::bglB 的构建策略见图 2-1A。通过 PCR 方法克隆得到了 B.polymyxabglB 大小为 1358bp，所得 bglB 基因序列与 B.polymyxa 的 bglB 基因（GenBank 登录号M60211.1）序列比对同源性为 99%。将 bglB 片段连接质粒 pET-28a 转化 E.coli DH5α，构建的重组质粒 pET-28a::bglB 经 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切验证无误后转化 E.coli C41，质粒双酶切验证图谱如图 2-2，该结果说明重组质粒 pET-28a::bglB 已成功转入 E.coli C41 中。将得到的 E.coli 重组菌株命名为 EB（pET-28a::bglB）。2.2 bgl 克隆与表达载体的构建重组质粒 pET-28a::bgl 的构建策略见图 2-1B。利用 PCR 获得 bglA、bglB 基因片段，双酶切后连接到质粒 pBluescriptⅡKS(+)获得重组质粒 pBluescript ⅡKS(+)::bgl，通过 SmaⅠ和 BamHⅠ酶切验证无误后（图 2-2），将 bgl 基因片段从重组质粒 pBluescriptⅡKS(+)::bgl上切下并连接质粒 pET-28a，获得重组质粒 pET-28a::bgl，通过 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切验证无误后（图 2-2）转化 E.coli C41 挑选阳性重组子提取质粒，，测序后证明所得片段正确，说明共表达重组质粒 pET-28a::bgl 已成功转入 E.coli C41 中。将得到的共表达重组菌株命名为 EAB（pET-28a::bgl）。AB

-。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12750bp2000bp500bp图 2-2 β-葡萄糖苷酶基因重组质粒的双酶切Fig.2-2 β-glucosidase gene recombinant plasmids digested by BaM：DNA Marker；1：pET-28a::bglA 重组质粒 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切；2组质粒 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切；3：pET-28a；4：pBluescriptⅡKS(+)；5：pBlu重组质粒 SmaⅠ和 BamHⅠ双酶切；6：pET-28a::bgl 重组质粒 BamHⅠ和 X1: pET-28a::bglA digested by BamHⅠand XhoⅠ; 2: pET-28a::bglB digested bⅠ; 3: pET-28a; 4: pBluescriptⅡKS(+); 5: pBluescriptⅡKS(+)::bgl digested bⅠ; 6: pET-28a::bgl digested by BamHⅠand XhoⅠ
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：2549852