谷子SiRLK35基因克隆及功能分析
发布时间：2019-10-16 19:18
【摘要】：为探讨谷子(Setaria italica L.)耐旱抗逆机制,解析类受体蛋白激酶(receptor like protein kinase,RLKs)基因功能,进而为培育谷子抗逆新品种提供依据,本文以干旱处理的谷子"豫谷1号"为材料,通过i TRAQ技术筛选到1个干旱响应的类受体蛋白激酶基因,命名为SiRLK35。以谷子RNA反转录的单链cDNA为模板,经PCR扩增获取SiRLK35基因全长序列。应用qRT-PCR方法,对SiRLK35在NaCl、PEG、ABA、GA、Me JA等不同处理下的表达模式进行分析。进一步构建基因原核表达载体pET28a-SiRLK35,结合斑点法对SiRLK35的抗盐能力进行初步评价。同时构建过表达载体p CAMBIA1301P-SiRLK35转化水稻,并对转基因植株抗盐能力进行检测。结果显示:胁迫及激素处理均可不同程度诱导SiRLK35基因的表达;斑点法研究结果显示,在相同NaCl浓度的LB平板上,含有SiRLK35基因的原核表达载体的大肠杆菌菌株生长状态较阴性对照好,SiRLK35具有一定的抗盐能力;获得的转SiRLK35基因水稻植株对盐胁迫的耐受性高于对照。SiRLK35基因对不同胁迫均可以产生响应,但对盐胁迫的响应较为明显,推测该基因可能在谷子的抗盐及抗逆过程中发挥作用。
【图文】：
416遗传Hereditas(Beijing)2017第39卷图1植物表达载体pCAMBIA1301P-SiRLK35重组质粒图谱Fig.1MapoftherecombinantplasmidofpCAMBIA1301P-SiRLK35伤组织，经共培养、潮霉素筛选获得转基因植株。参照Jefferson[18]染色方法对T1代转基因植株进行GUS组织化学染色鉴定，按照GUS:GUS缓冲液=1:9的比例配制GUS染液，剪取1~1.5cm转基因水稻叶片置于GUS染液中，以中花11为阴性对照，37℃过夜，使用75%酒精脱色至阴性对照为白色，观察染色结果并拍照记录。参照CTAB法[19]提取转基因水稻基因组DNA，以中花11为对照，并以此基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。扩增体系为：引物SiRLK35S11及引物SiRLK35A11各0.5μL、2×EasyTaqSuperMix10μL、cDNA1μL、ddH2O补齐到20μL。反应程序94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min20s，34个循环；72℃10min。1.2.8转基因水稻抗盐能力检测选取3个阳性转基因株系，分别命名为FK3-2、FK3-4、FK3-7，挑选籽粒饱满的T1代水稻种子于培养皿中，使用含有潮霉素(30mg/L)溶液筛选6~7d后，将抗性苗移入广口瓶中，，于营养液中继续培养至三叶期，测量地上及地下部分长度，记录数据。之后进一步将幼苗分别用0mmol/L、100mmol/L和250mmol/L的NaCl溶液进行处理，以未处理的中花11为对照。观察比较转基因水稻与中花11在不同盐浓度胁迫下生长状态、表型差异，并拍照记录。对处理3d后的幼苗，分别测量苗高及根部长度，记录数据。2结果与分析2.1谷子SiRLK35基因的克隆以谷子经反转录获得的单链cDNA为模板，以SiRLK35S11、SiRLK35A11为引物进行PCR扩增，得到一条1200bp左右的条带，与预期片段大小一致，进一步经测序验证，证明其为目的条带。2.2谷子SiRLK35基因表达模式分析2.2.1盐胁迫、PEG模
第5期王一帆等:谷子SiRLK35基因克隆及功能分析417处理时间的延长，在处理12h后基因表达受到明显诱导，其表达水平约为处理前的15倍，之后基因表达量随处理时间的延长而逐渐降低，在NaCl处理24h后基因表达量下调至处理前的0.2倍(图2A)。经20%PEG6000模拟干旱处理后，SiRLK35前期表现为诱导表达，其表达量随处理时间的延长而升高，在处理6h后基因表达量达到最高值，较处理前上调约38倍，之后随干旱处理时间的延长，基因表达量有所下降，在干旱处理12h后，基因表达水平较低，但仍高于对照，为处理前表达量的5倍，进一步处理24h后，基因表达水平基本没有改变(图2B)。自然干旱处理至6d后，SiRLK35基因相对表达量下降了大约4倍，明显低于未处理时的水平(图2C)。2.2.2激素处理下SiRLK35表达模式分析如图3所示，在不同激素处理下，SiRLK35具有不同的响应模式(图3)。经GA处理6h，基因表达表现为先上调后下降，但表达量变化不大，随处理时间的延长，经GA处理12h之后，基因的表达较对照明显降低(图3A)。而经ABA、MeJA处理后，基因表达趋势较一致，表现为处理后表达量略有降低，之后随处理时间的延长，在处理12h后，表达量都达到了较高的水平，其中100μmol/LABA处理12h后，基因表达量约为未经处理的8倍(图3B)，而100μmol/LMeJA处理12h后，基因表达量约为处理前的4倍，之后基因表达量逐渐降低至未处理时的表达水平(图3C)。2.3斑点法对SiRLK35抗盐能力的离体检测斑点法检测SiRLK35基因抗盐性结果如图4所示，含有不同质粒的大肠杆菌菌株，其生长均不同程度受到NaCl的抑制，菌落数量随所生长平板中NaCl浓度的升高而不同程度的减少；且在相同NaCl浓度的LB平板上，含有pET28a-SiRLK35重组质粒的BL21(DE3)菌株的生长好于含有pET28a空载体的?
【作者单位】： 青岛农业大学生命科学学院;山东省农业科学院生物技术研究中心山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室;山东省农业科学院作物研究所;
【基金】：山东省重大科技专项(编号:2015ZDGS03001-2) 山东省农业科学院重大科技成果培育计划项目(编号:2015CGPY10) 山东省自然科学基金面上项目(编号:2016ZRC02178) 山东农业大学作物生物学国家重点实验室开放课题(编号:2015KF15)资助~~
【分类号】：S515
本文编号：2550127
【图文】：
416遗传Hereditas(Beijing)2017第39卷图1植物表达载体pCAMBIA1301P-SiRLK35重组质粒图谱Fig.1MapoftherecombinantplasmidofpCAMBIA1301P-SiRLK35伤组织，经共培养、潮霉素筛选获得转基因植株。参照Jefferson[18]染色方法对T1代转基因植株进行GUS组织化学染色鉴定，按照GUS:GUS缓冲液=1:9的比例配制GUS染液，剪取1~1.5cm转基因水稻叶片置于GUS染液中，以中花11为阴性对照，37℃过夜，使用75%酒精脱色至阴性对照为白色，观察染色结果并拍照记录。参照CTAB法[19]提取转基因水稻基因组DNA，以中花11为对照，并以此基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。扩增体系为：引物SiRLK35S11及引物SiRLK35A11各0.5μL、2×EasyTaqSuperMix10μL、cDNA1μL、ddH2O补齐到20μL。反应程序94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min20s，34个循环；72℃10min。1.2.8转基因水稻抗盐能力检测选取3个阳性转基因株系，分别命名为FK3-2、FK3-4、FK3-7，挑选籽粒饱满的T1代水稻种子于培养皿中，使用含有潮霉素(30mg/L)溶液筛选6~7d后，将抗性苗移入广口瓶中，，于营养液中继续培养至三叶期，测量地上及地下部分长度，记录数据。之后进一步将幼苗分别用0mmol/L、100mmol/L和250mmol/L的NaCl溶液进行处理，以未处理的中花11为对照。观察比较转基因水稻与中花11在不同盐浓度胁迫下生长状态、表型差异，并拍照记录。对处理3d后的幼苗，分别测量苗高及根部长度，记录数据。2结果与分析2.1谷子SiRLK35基因的克隆以谷子经反转录获得的单链cDNA为模板，以SiRLK35S11、SiRLK35A11为引物进行PCR扩增，得到一条1200bp左右的条带，与预期片段大小一致，进一步经测序验证，证明其为目的条带。2.2谷子SiRLK35基因表达模式分析2.2.1盐胁迫、PEG模
第5期王一帆等:谷子SiRLK35基因克隆及功能分析417处理时间的延长，在处理12h后基因表达受到明显诱导，其表达水平约为处理前的15倍，之后基因表达量随处理时间的延长而逐渐降低，在NaCl处理24h后基因表达量下调至处理前的0.2倍(图2A)。经20%PEG6000模拟干旱处理后，SiRLK35前期表现为诱导表达，其表达量随处理时间的延长而升高，在处理6h后基因表达量达到最高值，较处理前上调约38倍，之后随干旱处理时间的延长，基因表达量有所下降，在干旱处理12h后，基因表达水平较低，但仍高于对照，为处理前表达量的5倍，进一步处理24h后，基因表达水平基本没有改变(图2B)。自然干旱处理至6d后，SiRLK35基因相对表达量下降了大约4倍，明显低于未处理时的水平(图2C)。2.2.2激素处理下SiRLK35表达模式分析如图3所示，在不同激素处理下，SiRLK35具有不同的响应模式(图3)。经GA处理6h，基因表达表现为先上调后下降，但表达量变化不大，随处理时间的延长，经GA处理12h之后，基因的表达较对照明显降低(图3A)。而经ABA、MeJA处理后，基因表达趋势较一致，表现为处理后表达量略有降低，之后随处理时间的延长，在处理12h后，表达量都达到了较高的水平，其中100μmol/LABA处理12h后，基因表达量约为未经处理的8倍(图3B)，而100μmol/LMeJA处理12h后，基因表达量约为处理前的4倍，之后基因表达量逐渐降低至未处理时的表达水平(图3C)。2.3斑点法对SiRLK35抗盐能力的离体检测斑点法检测SiRLK35基因抗盐性结果如图4所示，含有不同质粒的大肠杆菌菌株，其生长均不同程度受到NaCl的抑制，菌落数量随所生长平板中NaCl浓度的升高而不同程度的减少；且在相同NaCl浓度的LB平板上，含有pET28a-SiRLK35重组质粒的BL21(DE3)菌株的生长好于含有pET28a空载体的?
【作者单位】： 青岛农业大学生命科学学院;山东省农业科学院生物技术研究中心山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室;山东省农业科学院作物研究所;
【基金】：山东省重大科技专项(编号:2015ZDGS03001-2) 山东省农业科学院重大科技成果培育计划项目(编号:2015CGPY10) 山东省自然科学基金面上项目(编号:2016ZRC02178) 山东农业大学作物生物学国家重点实验室开放课题(编号:2015KF15)资助~~
【分类号】：S515
本文编号：2550127
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